Физиологическое значение текучести мембран
Спиновые метки, использующиеся при изучении текучести мембран
Вращение мембранных белков
Латеральная диффузия липидов и белков в мембранах
Примеры латеральной диффузии компонентов мембран
Липидно-белковые взаимодействия
Изменения в липидном бислое, связанные с присутствием интегральных мембранных белков
Динамические свойства остова мембранных белков и их боковых цепей
Навигация
Вращение мембранных белков
Динамическое поведение мембранных систем и липидно-белковые взаимодействия
70319
знаков
0
таблиц
8
изображений
3. Вращение мембранных белков
Коэффициент вращательной диффузии мембранного белка, находящегося в плоскости бислоя, D., можно найти, представив белко
вую молекулу в виде цилиндра, который вращается вокрут одной оси. Пусть мембрана имеет вязкость г) и толщину h, а радиус цилиндра равен а. Тогда
Часто наряду с фу применяется время вращательной релаксации ф, = 1/. Для белковой молекулы радиусом 25 А, находящейся в мембране толщиной 40 А и вязкостью 5 пуаз, величина ф, по оценкам составляет около 35 мкс. С количественной точки зрения это уравнение, описывающее вращение белка в бислое, не вполне строго, но зависимость времени вращательной релаксации от эффективного радиуса вращающейся белковой молекулы сомнений не вызывает. Это оказалось весьма полезным для исследования процессов агрегации белков внутри мембраны. Методы, применяемые для изучения вращения белков в бислое, должны быть способны регистрировать времена вращения от 10"5 до 10 ~3 с. Обычный метод измерения деполяризации флуоресценции в этом случае непригоден, поскольку время жизни молекул в возбужденном состоянии составляет около 10"8 с, и в таком временном масштабе молекулы белков представляются неподвижными. Успешно использовались три метода.
1. К исследуемому белку присоединяют зонд, время жизни которого в возбужденном триплетном состоянии достаточно велико. Если метка жестко связана с белком, то для регистрации вращения белка можно использовать измерение анизотропии фосфоресценции. Для таких измерений оказались пригодными производные эозина, поскольку время жизни эозина в триплетном состоянии составляет примерно 2 мс. В основе этого подхода лежат те же принципы, что и в основе метода деполяризации флуоресценции, но используется другая молекулярная модель движения, вызывающего деполяризацию. Эксперимент состоит в определении характерного времени затухания анизотропии фосфоресценции. Если система гетерогенна, могут возникнуть определенные трудности, связанные с количественным анализом экспоненциальной кривой затухания анизотропии. Проблемы возникают и в тех случаях, если метка может локально вращаться на поверхности мембранного белка или если у белковой молекулы имеются гибкие сегменты.
Те же метки могут использоваться и для анализа вращения белков с использованием временной зависимости дихроизма поглощения. В этом случае изменения в ориентации дипольного момента перехода регистрируются по поглощению света, поляризованного параллельно и перпендикулярно оси поляризации начального импульса, используемого для возбуждения молекул.
2. Известны случаи, когда сами молекулы белка содержат группы, переходящие при флеш-фотолизе в долгоживущее возбужденное состояние, параметры которого можно оценить с помощью дихроизма поглощения. В качестве примера можно привести родопсин и бактериородопсин, где используются возбужденное состояние связанного ретиналя и возбужденные состояния, наблюдающиеся при фотолизе комплексов цитохром—СО с использованием цитохром с-оксидазы и цитохрома Р450. Измерения можно проводить in situ или с очищенным белком, встроенным в фосфолипидные везикулы.
3. С помощью обычной ЭПР-спектроскопии не удается регистрировать вращения, характерная частота которых равна частоте вращения мембранных белков. Однако разработан специальный метод — ЭПР с переносом насыщения, диапазон чувствительности которого очень широк — от 10"7 до 10 ~J с. Этот метод применялся при изучении вращения нескольких мембранных белков с ковалентно пришитыми к ним спиновыми метками. Недостаток метода состоит в том, что в случае анизотропного молекулярного движения спектры с трудом поддаются интерпретации.
3.1 Примеры вращения белков
Внутримембранные белки характеризуются широким спектром времен вращательной релаксации. На одном конце временной шкалы находится родопсин, который, по-видимому, свободно вращается в мембране наружного сегмента палочки сетчатки, а на другом — бактериородописин, который образует в пурпурной мембране упорядоченную кристаллическую решетку и неподвижен. Для нескольких очищенных белков, встроенных в фосфолипидные везикулы, зависит от концентрации. Это позволяет предположить, что при уменьшении соотношения липид/белок происходит самоагрегация этих белков. Такая картина характерна для бактериородопсина, цитохром с-оксидазы, белка полосы 3, Са2+ -АТРазы и цитохрома Р450. Возможно, именно с самоагрегацией связана гетерогенность, наблюдаемая, в частности, для белка полосы 3 в тенях эритроцитов и Са2+ -АТРазы из саркоплазматического ретикулума. Вообще говоря, мембранные белки, по-видимому, вращаются в плоскости мембраны и скорость вращения согласуется с величиной, ожидаемой исходя из простой гидродинамической модели.
Дополнение. Вращение белка полосы 3 и цитохрома Р450: выявление межмолекулярных взаимодействий
Из двух указанных белков — белка полосы 3 и цитохрома Р450 — наибольший интерес представляет первый, поскольку по имеющимся биохимическим данным можно предположить, что этот анионный переносчик связан со спектрино-актиновой сетью цитоскелета. Обнаружение того факта, что значительная часть белковых молекул способна к быстрому вращению, послужило основанием для создания моделей, согласно которым белок полосы 3 иммобилизован не полностью или образует со спектрином временную связь. Однако ситуация осложнялась тем, что при лизисе клеток, необходимом для получения теней эритроцитов, комплекс с цитоскелетом может разрушаться. В интактной клетке белок полосы 3 совершает только медленные вращательные движения с характерным временем 0,1 — 1 мс. Это больше согласуется с отсутствием поступательного движения белка полосы 3, хотя физическая причина такого ограничения подвижности не установлена.
Цитохром Р450 акцептирует электроны от цитохром Р450-редук-тазы в электронтранспортной цепи микросом. Многих ученых интересовал вопрос: образуют ли эти молекулы долгоживущий комплекс в мембране или их взаимодействие сводится к простым столкновениям в результате диффузии? При низком соотношении липид/белок цитохром Р450 агрегирует и вращение его замедляется. Однако в присутствии стехиометрических количеств редуктазы цитохром Р450 в сходных условиях остается мобильным. Это свидетельствует о взаимодействии двух указанных белков и образовании комплекса между ними со стехиометрией 1:1, которое препятствует агрегации Р450.
Похожие работы
... является курсом, для изучения которого необходимо наличие знаний об основных принципах организации биологических молекул, строении и механизмах действия ферментов. Дисциплина биохимия мембран относится к дисциплинам специализации федерального компонента. 5. Распределение времени, отведенного на изучение дисциплины по учебному плану Форма учебной работы Форма обучения Очная По ...
... Рисунок Кинетика биопроцессов Динамические свойства биопроцессов Каждая система состоящая из элементов будет характеризоваться динамикой, складывающейся из элементов. Кинетика биопроцессов – раздел биофизики, изучающий динамические свойства биопроцессов. 1. Параметры, меняющие свое значение со временем. Переменные величины: численность клеток, биомасса, концентрация ...
... и индуцируют трансмембранную миграцию липидных молекул, поэтому полученные результаты бывает трудно интерпретировать. Детальная оценка достоинств и недостатков методов изучения липидной асимметрии в мембранах дается, например, в обзорах. МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ ТРАНСМЕМБРАННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ Химическая модификация фосфолипидов Относительно легко подвергаются химической модификации только ...
... правильным только благодаря взаимной компенсации ошибок, однако в историческом плане эта работа имела большое значение, поскольку с тех пор концепция липидного бислоя как структурной основы биологических мембран стала доминирующей и на самом деле оказалась верной. Концепция бимолекулярной липидной мембраны получила дальнейшее развитие в предложенной в 1935 г. модели Дэвсона-Даниелли, или ...
0 комментариев