Навигация
М раствором сульфата аммония осаждаются все белки сыворотки, включая альбумин
33450
знаков
0
таблиц
3
изображения
4 М раствором сульфата аммония осаждаются все белки сыворотки, включая альбумин.
В этой фракции, содержится основная масса иммуноглобулинов G1 и G2 и значительное количество IgМ и IgА , хотя последние обычно обнаруживаются и в надсадочной жидкости. Поэтому осадок, полученный 4 М раствором сульфата аммония, может служить источником приготовления всех классов иммуноглобулинов, что имеет большое значение, особенно для выделения их из одной пробы сыворотки.
ОСАЖДЕНИЕ 2,78 М РАСТВОРОМ АММОНИЯ
К холодной сыворотке крови добавляют равный объем холодного 2,78 М раствора сульфата аммония, перемешивают при 40С 2 ч. Сладок растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждают еще 2 раза. При этом 2,78 М раствором сульфата аммония в основном осаждаются иммуноглобулины класса G. Причем , такая концентрация соли осаждает IgG2 и , что очень важно, наиболее полно IgG1 при минимальном осаждении фракций - и - глобулинов. Поэтому данный метод наиболее удобен для выделения иммуноглобулинов G1 и G2 как из сыворотки крови лошадей, так и овец и крупного рогатого скота.
ОСАЖДЕНИЕ 1,39 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА
АММОНИЯ ПУТЕМ ДИАЛИЗА
Охлажденную сыворотку крови животных в целлофановом мешочке помещают в 1,39 М раствор сульфата аммония, перемешивают в холодильнике магнитной мешалкой 2 суток при трехкратной смене раствора соли. Осадок дважды промывают 1,39 М раствором аммония.
При этом из сыворотки крови овцы и крупного рогатого скота осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, однако иммуноглобулин G1, - и - глобулины присутствуют лишь в следовых количествах. Из сыворотки крови лошадей, главным образом выделяется иммуноглобулин G2, IgG(Т) присутствует лишь в небольшом количестве.
Таким образом, препарат получаемый 1,39 М раствором сульфата аммония путем диализа удобен для выделения IgG2из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота, однако наиболее чистый IgG2 получается из сыворотки крови лошадей.
ОСАЖДЕНИЕ СУЛЬФАТОМ НАТРИЯ
К охлажденной сыворотке крови по каплям добавляют холодный 2,53 М раствор сульфата натрия до конечной концентрации, равной 1 М. Перемешивают 2 час в холодильнике, осадок растворяют и диализируют. 1 М раствором сульфата натрия осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, практически свободные от фракции -глобулинов. По нашим данным, этот метод достаточно прост и выгоден для выделения иммуноглобулинов G1 и G2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота. Недостаток метода в том, что такая концентрация соли не обеспечивает полного осаждения иммуноглобулина G1. По составу, препарат, выделяемый сульфатом натрия, идентичен препарату, получаемому 1,39 М раствором сульфатом аммония, поэтому он наиболее пригоден для выполнения иммуноглобулина G2.
ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА ДЭАЭ - СЕФАДЕКСЕ А-50
Предварительно очищенные белки сыворотки выделяли на ДЭАЭ-сефадексе А-50 типа средний (100-200 меш). Предварительную обработку и регенерацию ДЭАЭ -сефадекса А-50, а также выделение белков, 0,01 М калий- фосфатным буфером, рН 6,5 проводили по J.Baumstark et al (1964) с незначительными изменениями (Сеитов З.С., Жумашев Ж.Ж.,1966).
Выделенный белок изучали электрофорезом в агаровом геле, где в зоне -глобулинов обнаруживались две нечетко разделенные -глобулиновые фракции - IgG1 и IgG2, а иммуноэлектрофорезом, - три линии преципитации - IgG1, IgG2 и IgM. Таким образом, применив метод J.Baumstark et al (1964) не получили чистые фракции IgG1 и IgG2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота, а только их смесь.
Следует подчеркнуть, что указанные авторы разработали способ выделения чистого IgG из нормальной сыворотки крови человека, испольэуя ДЭАЭ -сефадекс А-50 типа грубый и 0,01 М калий- фосфатный буфер рН, 6,5 . Однако З.С. Сеитов и Ж.Ж.Жумашев (1966) этим методом не смогли выделить иммунохимически чистый иммуноглобулин G2 из сыворотки крови лошадей. Им удалось выделить смесь белков состоящую из IgG2 и IgМ и IgА. Аналогичные результаты получены при выделении IgG2 из из нормальной сыворотки овец (Ж.Ж.Жумашев, З.С.Сеитов, 1968 а, б).
Результаты, отличные от результатов Baumstark et al (1964), по-видимому , обусловлены особенностями белкового состава сыворотки крови этих видов животных. Таким образом, указанный метод - также способ предварительного выделения IgG2 из нормальной сыворотки крови.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключение необходимо отметить, что американскому биохимику G.Edelman (1972) и английскому биохимику К.РогIgг (1972), работающим в области изучения человеческих иммуноглобулинов была присуждена Нобелевская премия 1972 года. Присуждение Нобелевской премии указывает на большое внимание мировой научной общественности к иммуноглобулинам и на достижение определенных успехов з изучении иммуноглобулинов человека.
Что касается иммуноглобулинов сельскохозяйственных животных, то, к сожалению, многие вопросы выделения, идентификации и количественного определения этих защитных белков остаются еще слабо разработанными.
Главный защитный белок сельскохозяйственных животных IgG. Причем он существует в виде двух подклассов: G1 и G2, которые различаются аминокислотным составом, электрофоретической подвижностью, антигенным и биологическим свойствам. Однако выделение из сыворотки крови чистых препаратов IgG1 - очень сложная, и следовательно, не до конца решенная проблема.
Поэтому большинство литературных данных по этому вопросу касается IgG и лишь немногие IgG1 и IgG2.
IgM один из высокомолекулярных и сложноорганизованных белков сыворотки крови, состоящий из 5 субъединиц, соединенных лабильными дисульфиными связями. Этим и объясняется трудность его выделения и изучения. Хотя существуют несколько современных методических приемов, помогающих его выделению, ни один из них в отдельности не обеспечивает получения чистого IgМ. Поэтому необходимо использовать комбинированные методы, основанные на особенностях его физико-химических свойств.
Так, до сих пор остается сложной задачей приготовление высокоочищенного IgМ, пригодного для изучения его структурных особенностей и аминокислотного состава, антигенных свойств, а также получение к нему моноспецифических иммунных сывороток. По-видимому, этим и объясняется отсутствие работ по изучению пептидной структуры и аминокислотного состава IgМ у различных видов животных. Относительно мало работ, выполненных с помощью моноспецифических иммунных сывороток к IgM у животных, особенно у лошадей и овец.
Однако особый интерес, особую сложность для выделения представляет IgА, в частности у жвачных - крупного рогатого скота и овец. Это прежде всего связано с его небольшим содержанием в нормальной сыворотке крови. IgА относительно хорошо изучен только у человека благодаря появлению гибридом и моноклональных антител.
Изучение IgА у сельскохозяйственных животных начато недавно. Так, не изучены его структурные особенности и аминокислотный состав, слабо - электрофоретические, хроматографические и гель-фильтрационные свойства и молекулярные размеры.
Изучение иммунологического статуса животных методом радиальной иммунодиффуэии с использованием моноспецифических иммунных сывороток имеет практическое значение. Однако в настоящее время почти отсутствуют исследования по установлению уровня иммуноглобулинов у отечественных пород крупного рогатого скота, овец, лошадей и других сельскохозяйственных животных. Неизвестно также, как изменяется количественное соотношение иммуноглобулинов в зависимости от породы, пола, возраста, сезонов года и продуктивности животного. Пока мало исследованы иммуноглобулиновый спектр новорожденных и динамика содержания иммуноглобулинов в возрастном аспекте, особенно у лошадей и овец.
Изучение иммуноглобулинов человека показало, что во многих случаях нарушается биосинтез иммуноглобулинов, обусловливающий изменения нормального соотношения их в сыворотке. Такие исследования проведены только у человека и отсутствую у сельскохозяйственных животных. Пока не изучены и качественные и количественные изменения состава иммуноглобулинов при различных заболеваниях инфекционного и инвазионного характера.
Слабо изучена природа иммунного ответа у вакцинированных животных, особенно крупного рогатого скота и овец. Многочисленные исследования общего белка и его фракций у различных животных проведены главным образом методом электрофореза на бумаге, который имеет ограниченную аналитическую возможность. Это справедливо в отношении динамики белковых фракций сыворотки крови у молодняка сельскохозяйственных животных в возрастном аспекте, а также иммуноглобулинового, белкового и казеинового состава молозива и молока овец и лошадей.
Таким образом, исследование иммунохимических особенностей и количественного содержания иммуноглобулинов сельскохозяйственных животных имеет как теоретическое, так и практическое значение.
ЛИТЕРАТУРА
1. Басова Е.Н., Стефани Д.В. Некоторые особенности выделения миеломных IgG человека различных субклассов и их распределение по аллотипам, субклассам и типам легких цепей// Журн. микробиолог. - 1977. - №5. - С. 77-81.
2. Басова Е.Н., Стефани Д.В., Казанцева Л.З. Иссчледования субклассов IgG человека. Сооб.II. Уровни отдельных субклассов IgG в парных сыворотках крови жителей северного села - изолята// Журн. микробиолог. - 1979. - №7. - С. 35-39.
3. Бернет Ф. Клеточная Иммунология. - М.: Мир, 1971. - 549 с.
4. Edelman J.M. Antibody structure and molecular immunology//Nobel lecture. Dec. 12 1972; Stocholm, 1973. - p. 147-170
5. Heimer R., Clark L.C., Mourer P.H. Immunoglobulins of sheep//Arch. Biochem. Biophys. - 1969 - v.131. - p. 9-17.
6. Kehoe J.M., Tomosi T.B., Ellous F., Capra J. Identification of J-chain in a homogeneous canine IgA immunoglobulin//J. Immunol - 1972 - v.109 - p.59-64.
7. Menta P.D., Reichin M. Comparative studies of vertebrate immunoglobulins//J. Immunol - 1972 - v.109 - p.1272-1277.
8. Ж.Ж.Жумашев, М.Б.Бабаев, Ш.С.Алимжанова, М.А.Туганбекова. Иммуноглобулины животных. Алматы. 199
Похожие работы
... на его течение профессиональные вредности и стрессовые ситуации. Все это необходимо учитывать при диагностике и лечении атопического дерматита у пациентов разных возрастных группК л и н и ч е с к и е ф о р м ы а т о п и ч е с к о г о д е р м а т и т а. Единой классификации форм атопического дерматита в литературе нет. Многие авторы, в зависимости от возраста больных выделяют несколько форм ...
... удовлетворительного фракционирования белков объем наносимого раствора не должен превышать 3-5% общего объема колонки. Ввиду этого к гель-хроматографии обычно прибегают в середине или на завершающих этапах выделения белка. Разумеется, при отделении низкомолекулярных примесей, в частности при обессоливании, объем образца может быть значительно большим, поскольку не требуется высокого разрешения. В ...
... ориентация V генов у них изменена. Следует отметить, что сомовые и лососевые являются довольно специализированной группой, возникшей в эволюции относительно недавно (Рис. 8). Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966). В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и организации генов L-цепей ИГ у ...
... зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического анализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется теми же способами, что и индикаторные методы иммунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют восполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его фенотипической экспрессии (вирусы, встроенные в геном, «молчащие» гены ...
0 комментариев