Серологическая идентификация культур H.parasuis A.pleuropneumoniae

2.1.6. Серологическая идентификация культур H.parasuis A.pleuropneumoniae.

2.1.6.1. Методы и результаты серологической идентификации культур H.parasuis.

Использовали кроличьи гипериммунные сыворотки против типовых штаммов сероваров А, В, С, Д.

Дифференциация сероваров H.parasuis в пробирочной РА показала её малую специфичность. Более эффективной для указанной цели оказалась РСК с растворимыми антигенами.

Исследование в РСК с типовыми сыворотками 46 эпизоотических культур H.parasuis, выделенных при генерализованных серозитах, позволило 47,82% культур отнести к известным сероварам Бакоса. Штаммы серовара А составили 15,2%, В - 17,39%, С - 2,17%, Д-13,04%. В группе штаммов, выделенных из лёгких при пневмониях (18шт), культуры серовара А составили 16,6%, В - 11,1%, С - 5,56%, Д -33,3%, нетипируемые -33,3%. В числе культур, выделенных из носовой слизи клинически здоровых свиней (14 шт.), 35,7% отнесены к серовару А, 14,2% -- к серовару Д, не удалось типировать 50% штаммов.

В целом по всей группе из 78 штаммов H.parasuis было отнесено к серовару А - 19,23%, В - 12,82%, С - 2,56%, Д - 17,95%, нетипируемые культуры составили 47,44%.

Исследование нетипируемых культур в РСК свиноводства атисыворотками против изоляторов этой же категории показало наличие ещё трёх серологических вариантов и часть культур осталась за пределами этих групп. Полученные данные позволяют заключить, что необходимо расширение числа сероваров на базе схемы Бакоса, либо требуется создание новой схемы серовариантной дифференциации с новыми типовыми штаммами.

Анализ серотиповой структуры культур, выделенных в пределах одного хозяйства показал ассоциацию с генерализованными серозитами свиней H.parasuis различной серовариантной принадлежности.

2.1.6.2. Методы и результаты серологической идентификации культур A.pleuropneumoniae.

Для серовариантной дифференциации культур A.pleuropneumoniae испытывали РА пробирочную, РА с 2-МЭ, РА на стекле, РНГА, РНГА с 2-МЭ, РКА пробирочную на стекле, двухступенчатую РИФ. При внутривидовой дифференциации в различных серологических реакциях типовых культур A.pleuropneumoniae (серовары 1,2,3,4,5,6,7,8, 10,12) установлены перекрёстные реакции между сероварами 3,6 и 8, 2 и 3, 1 и 2, 4 и 7. Исследование двухсторонних антигенных связей в большинстве случаев позволяет определить серовариантную принадлежность культур. Из группы ускоренных серологических реакций для серологической идентификации наиболее перспективна РКА с растворимыми антигенами.

При серологической идентификации 82 эпизоотических НАД--зависимых культур бактерий, выделенных при фиброзно-геморрагических пневмониях свиней и классифицированных как A.pleuropneumoniae отнесены к серовару 2 -12,9%, 3 -14,53%, 4 -8,53%, 6 -3,65%, бактериям «малой группы» -7,31%. Большую группу штаммов серологически идентифицировать не удалось. Культуры последней группы имели антигенное родство с сероварами 3,6,8,10, но при исследовании в перекрёстной РА с адсорбцией были не идентичны им.

2.1.7. Результаты изучения широты распространения сероваров A.pleuropneumoniae на основании серологических исследований.

Была предпринята попытка дать оценку циркуляции различных сероваров A.pleuropneumoniae в свиноводческих хозяйствах одной из областей центральной России по результатам серологических исследований. В РНГА исследовали 639 сывороток крови свиней из десяти хозяйств. Установлено преобладание антител к сероварам 1,4,6,3,2,12. При бактериологическом исследовании в данном регионе культур сероваров 1 и 12 не выделяли. Причины такой ситуации требуют дальнейшего изучения. В сыворотках крови некоторых серопозитивных свиней удалось выявить нейтрализующие антитела к гемолизинам A.pleuropneumoniae, что свидетельствует о наличии определённого иммунитета к A.pleuropneumoniae.
2.1.8. Разработка и апробация ускоренных серологических методов обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae в патологическом материале.

Для обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae непосредственно в тканевом материале были испытаны реакции коагглютинации (РКА) и двухступенчатой иммунофлуоресценции (РИФ).

Опыты показали, что РКА может быть использована для видовой и серотиповой идентификации A.pleuropneumoniae. Серотиповую специфичность результатов РКА удаётся повысить путём уменьшения дозы сыворотки для сенсибилизации носителя и использования в реакции растворимых капсульных антигенов. Более активные видовые диагностикумы удалось сконструировать при использовании поливалентных сывороток, полученных от кроликов, иммунизированных не моноантигенами, а смесью антигенов A.pleuropneumoniae различных сероваров. Использование РКА как метода видовой идентификации потребовало выяснения межвидовых антигенных связей A.pleuropneumoniae. Изучали антигенное родство данного вида бактерий с A.suis, A.lignieresii, P.multocida (А,В,Д), H.parasuis (A,B,C,Д), B.bronchiseptica, S.cholerasuis, S.tiphimurium. Наиболее выраженное антигенное родство установлено с A.suis и A.lignieresii, наличие которых в исследуемом материале может обусловить ложноположительные результаты РКА.

Серовариантную дифференциацию типовых культур A.pleuropneumoniae проводили в РИФ с предельными разведениями антисывороток первой ступени, обеспечивающими свечение клеток свиноводства гомологичными реагентами на четыре креста. Обнаружили перекрёстные реакции сероваров 1 и 2, 2,3 и 6, 3,2,6 и 8, 4 и 7, 10 и 12. Таким образом, надёжной серовариантной дифференциации в ряде случаев добиться не удалось. Слабые перекрёстные реакции интенсивностью на два креста получены с культурами A.suis, A.lignieresii. Не отмечено перекрёстных реакций с P.multocida (А,В,Д), H.parasuis (А,В,С,Д), E.coll, S.cholerasuis и S.tiphimurium.

При изучении специфичности РКА как метода обнаружения антигенов возбудителя в органах и тканях исследовали супернатанты тканевых (лёгочных) гомогенатов клинически здоровых свиней, морских свинок и получили неспецифические замедленные положительные реакции. Для устранения неспецифической аглютинации стафилококковые антительные диагностикумы дополнительно обрабатывали нормальной кроличьей сывороткой, увеличивали концентрацию альбумина в диагностикуме, прогревали исследуемый материал при 100°С (10,60 мин.) 120°С (15 мин.). Эффективной оказалась термическая обработка материала. Необходимость прогревания исследуемого материала заставила рассмотреть влияние этого фактора на антигены возбудителя. Известно, что клетки A.pleuropneumoniae содержат специфические термостабильные и – лабильные антигены (K.Mittal et al., 1987). Изучение этого вопроса показало, что по термостабильности антигенов культуры можно подразделить на группу термоустойчивых (сер.2,3,6,8,10) и термолабильных (сер.1,7, штамм 202). У культур последней группы при кипячении (60 мин.) снижалась активность антигенов в серологических реакциях, особенно антигенов серовара 1 (шт.ССМ5869). Прогревание антигенов A.pleuropneumoniae при 100°С в течении 10 минут на серологической активности антигенов возбудителя, кроме серовара 1 не сказывается.

Возможность выявления антигенов возбудителя в тканевом материале (лёгкие), при помощи РКА и РИФ первоначально изучали на морских свинках, белых мышах и свиньях, заражённых культурами A.pleuropneumoniae, а также A.suis и гемофильными бактериями «малой группы».

Результаты исследований показали совпадение данных бактериологии РИФ и РКА. Слабые положительные реакции были получены с тканевым материалом, содержащим A.suis.

При исследовании лёгочной ткани от 78 свиней с явлениями пневмонии из 29 материалов были выделены микоплазмы, из 15 -стафилококки или стрептококки, изменений 16 - P.multocida, из 2 - P.multocida и гемофильные бактерии «малой группы», из 7 - гемофильные бактерии «малой группы», из 9 - S.cholerasuis. При наличии в патологическом материале P.multocida в двух случаях были получены позитивные результаты РКА с диагностикумом против штамма №202 («малая группа»), не подтверждённые данными бактериологии. В остальных случаях при исследовании материалов, содержащих указанные выше гетерологичные виды бактерий результаты РКА и РИФ были отрицательными. В девяти случаях изоляции культур «малой группы» данные бактериологических исследований, РКА и РИФ совпали.

Полученные данные позволяют оценить РКА и РИФ как достаточно специфические и чувствительные методы обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae. Преимуществом РКА является возможность исследования длительно хранившегося материала и выявления растворимых антигенов.