Результаты исследований

2. Результаты исследований.

2.1. Свойства возбудителей, таксономическое положение и разработка лабораторной диагностики актинобациллёзной (гемофилёзной) плевропневмонии и гемофилёзного полисерозита свиней .
2.1.1. Питательные среды и культивирование A.pleuropneumoniae и H.parasuis.

Конструирование питательных сред для культивирования A.pleuropneumoniae и H.parasuis предполагает учёт потребности данных видов в НАД. Минимальный уровень зоны оптимума у обоих видов бактерий близок и составляет 1,8 - 3,6 НАД в 1 среды. Верхний пороговый уровень имеет видовые и штаммовые различия, причём он ниже у H.parasuis (15,62 – 31,25 мкг/), чем у A.pleuropneumoniae (250мкг/) и, в свою очередь, он меньше в пределах вида H.parasuis у свежевыделенных эпизоотических штаммов, нежели у адаптированных музейных культур. Полученные данные позволили обоснованно конструировать питательные среды свиноводства учётом возможных штаммовых потребностей в НАД. Из естественных источников НАД наиболее доступен и эффективен дрожжевой экстракт. Переживающие животные ткани также содержат достаточное для роста V - зависимых бактерий количество НАД. Наиболее удобно в этом случае использовать кровяной сгусток на агаре Цинссера или сывороточном агаре.

Испытание различных видов питающих культур бактерий как продуцентов НАД показало, сто ростовой фактор экскретируют в достаточных количествах интенсивно растущие виды бактерий (эшерихии, сапрофитные бациллы, стафилококки), которые обеспечивают зону от 16,8 ± 0,89 мм до 31,6 ± 1,14мм в зависимости от вида бактерий и типа питательной среды.

Однако, при использовании культур стафилококков, установили, что некоторые из них ингибируют сателлитный рост A.pleuropneumoniae. Мы не обнаружили описание подобного феномена, хотя он известен у P.multjcida. Но в литературе есть сообщения о наличии гиалуроновой кислоты в составе капсулы некоторых штаммов A.pleuropneumoniae. Следовательно, причиной ингибиции роста может быть синтез культурой стафилококка гиалуронидазы. Мы также не исключаем вероятность образования продуцентом НАД соединений типа НАД-азы. В любом случае, питающая культура бактерий должна быть предварительно проверена по указанному критерию.

Определение НАД - зависимости – важный этап в идентификации A.pleuropneumoniae (1-й биовар) и H.parasuis. Наши данные о том, что референтные и эпизоотические культуры A.pleuropneumoniae периодически могут утрачивать НАД- зависимость, причём это касается любого штамма 1-го биовара. Явление НАД -зависимости может быть восстановлено у культур, утративших это свойство, путём культивирования на «обеднённой» питательной среде с локальным источником НАД. Следовательно на обычных питательных средах животного происхождения культуры, потерявшие НАД зависимость, утилизируют какие-то предшественники НАД, отсутствующие, например, в глюкозо-казеиновом агаре. На последней питательной среде их рост возможен только в присутствии НАД, зависимость от которого они приобретают вновь.

Результаты исследований по изучению НАД - зависимости гемофильных бактерий позволили нам дать оценку и рекомендовать для практических целей сочетание питательных сред, позволяющих в условиях диагностической лаборатории тестировать V - и Х - зависимость.

Исследования показали отсутствие СО2 - зависимости у изученных культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae, а также не удалось обнаружить существенных различий в частоте изоляции культур из патологического материала в условиях обычной атмосферы и повышенного содержания СО2 . Оба вида бактерий показали сильную зависимость от наличия в питательной среде сыворотки крови. У H.parasuis эта потребность выражена сильнее, чем у A.pleuropneumoniae. При отсутствии в питательном субстрате сыворотки крови оба вида бактерий быстро диссоциируют.

Количественные показатели, характеризующие рост A.pleuropneumoniae и H.parasuis в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера, 120мг % аминного азота, рН 7,6,5,% сыворотки крови крупного рогатого скота, 10% дрожжевого экстракта), свидетельствуют о более интенсивном росте первого вида, в частности, период генерации соответственно составил 40,8 и 67 минут, удельная скорость роста 1,008 и 0,622, прирост бактериальных клеток за 1 час культивирования 0,44 и 0,27 log.

Оценка питательных сред для первичной изоляции культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae (1-й биовар) показала, что для этой цели могут быть использованы агар и бульон Левинталя, «шоколадный» агар, сывороточно-дрожжевой бульон и агар, сывороточный и кровяной агар, с локальными источниками V - ростового фактора. Предпочтительнее использование прозрачных питательных сред, позволяющих получать более полную информацию об особенностях колонии. Использование сред с локальными источниками НАД даёт важную информацию на первом этапе бактериологического исследования о НАД -зависимости, а в случае кровяного агара - также о гемолитической активности бактерий. Применение питающих бактерий как источника НАД требует отвивки культур в течении 24-48 часов из-за быстрой их гибели под влиянием метаболитов «баккормилок». Подращивание материала в течении 6-8 часов в сывороточно - дрожжевом бульоне, содержащем бацитрацин, с последующим рассевом на среды увеличивает вероятность выделения культур НАД--зависимых бактерий.

Для поддержания культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae при текущей работе в наибольшей степени подходят оптимальные плотные питательные среды с заливкой культур вазелиновым маслом при температуре хранения 5-8°С. Наиболее длительно сохраняют жизнеспособность (6-7 недель) культуры, выращенные в сгустках крови и сохраняемые в замороженном состоянии.

2.1.2. Методы и результаты идентификации НАД--зависимых бактерий, выделенных от свиней, по культурально - морфологическим, ферментативным и генетическим свойствам.

Исследование ферментативных свойств НАД – и гемин – зависимых культур бактерий проводили на рутинных дифференциально-диагностических средах с добавлением ростовых факторов, а также на жидких средах Гисса в микрообъёмах и диагностических системах ПБДЭ и СИБ Горьковского НИЭМ. Максимальное совпадение результатов было получено на общепринятых средах, в ПБДЭ и микрообъёмах.

Таксономическое положение 165 культур НАД--зависимых бактерий, выделенных от клинически здоровых свиней, а также животных с явлениями фибриозно-геморрагической плевропневмонии или генерализованных серозитов, было исследовано при помощи нумерического анализа. В качестве опорных в данную коллекцию культур были включены типовые штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, H.parasuis, H.parainfluenzae, H.influenzae, A.ligieresii, A.suis. У каждого исследованного штамма были определены 57 фенотипических признаков, характеризующих их культуральные и ферментативные свойства. Все полученные данные были преобразованы в числовую форму, подвергнуты нумерическому анализу свиноводства конечным представлением полученных результатов в виде дендрограммы.

Анализ дендрограммы показал, что все культуры объединяются в единый массив при уровне сходства 75,02%, после чего они подразделяются на два больших фенона: один с уровнем сходства 81,87%, включающий типовые штаммы A.lignieresii, A.suis, Haemophilus, (Actinobacillus), pleuropneumoniae и типовой штамм «малой группы» (фенон «А»), второй с уровнем подобия 81,997% включает типовые штаммы H.influenzae, H.parainfluenzae и H.parasuis (фенон «Н»). Из фенона «А», объединяющего культуры актинобацилл на уровне подобия 91,23%, выделяется фенон №1, включающий виды A.lignieresii и A.suis, и на уровне сходства 95,00% выделяется фенон №2, объединяющий эпизоотические культуры вокруг типового штамма «малой группы». При уровне подобия 89,48% формируется фенон №3, объединяющий эпизоотические штаммы вокруг типовых культур Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.

В феноне «Н» на уровне сходства 81,997% выделяется фенон №4-

-H.influenzae, на уровне 87,63% - фенон №5, объединяющий штаммы H.parainfluenzae и на уровне подобия 89,60% вокруг типовых штаммов H.parasuis концентрируется другая группа эпизоотических штаммов -

-фенон №6.

Следовательно, массив эпизоотических штаммов дифференцируется на три фенотипические группы, соответствующие видам Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, H.parasuis и «малой группе» гемофильных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о тяготении культур Haemophilus pleuropneumoniae не к роду Haemophilus, а к роду Actinobacillus.

С целью уточнения таксономического положения эпизоотических штаммов, классифицированных по фенотипическим свойствам как Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, НАД--зависимых бактерий, обозначаемых как Pasteurella-haemolytica- подобные бактерии, был определён нуклеотидный состав и уровень гомологии ДНК культур этих групп свиноводства представителями рода Haemophilus (H.parasuis, шт.J 95-таксон «С»), Pasteurella (P.multocida), Actinobacillus (A.suis), а также с типовыми культурами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.

Результаты показали, что все исследованные штаммы по ГЦ -составу образуют довольно однородную группу свиноводства крайними значениями 39,8 - 43,2 (=41,3±0,2). Такие значения вполне соответствуют приводимым в Руководстве Берги для семейства Pasteurellaceae. Несколько более высокий ГЦ состава обнаружен у P.haemolytica - подобных бактерий (42,5±0,5) по сравнению с типовыми штаммами A.pleuropneumoniae, (40,7±0,5). Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae имели показатель 41,2±0,1 мол% ГЦ.

Уровень гомологии ДНК внутри группы P.haemolytica - подобных штаммов составил 100%; ДНК бактерий этой группы (шт.2288/77) имела гомологию с ДНК типовых штаммов A.pleuropneumoniae - 75%; с ДНК A.suis - 33%, с ДНК P.multocida и H.parasuis не более 9%; с ДНК эпизоотических штаммов Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae - 75—83%.

Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae по данным гибридизации ДНК образуют генетически взаимосвязанную группу с уровнем подобия нуклеотидных последовательностей – 75-100%. В то же время бактерии этой группы тесно связаны с типовыми штаммами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae (78-98%), на уровне 33-38% гомологичных нуклеоидных последовательностей с ДНК A.suis , и только на уровне гомологии ДНК 5-9% с H.parasuis и 3-10% c P.multocida.

При интерпретации полученных результатов мы исходили из критериев генетического анализа, предложенных Медниковым и соавт.(1974), согласно которым культуры P.haemolytica - подобных бактерий не имеющие НАД—зависимости, могут рассматриваться как биовар Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae. В целом эпизоотические штаммы, выделенные при фибринозно - геморрагических пневмониях, P.haemolytica - подобные бактерии и типовые штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae предстают как видовая общность с заметной внутривидовой гетерогенностью. Подобный внутривидовой уровень гетерогенности не исключает выделения дополнительных внутривидовых таксонов, кроме НАД—зависимого и - независимого биоваров.

Полученные данные свидетельствуют, что культуры A.pleuropneumoniae, обозначаемые в 9-м издании Руководства по систематике бактерий Берги как видов рода Haemophilus, не относятся к нему, а также штамм J95 (таксон «С»), упоминаемый в числе видов рода Haemophilus, по данным гибридизации также не относится к роду Haemophilus.

На основании результатов нумерического анализа, с учётом частоты встречаемости тех или иных положительных ферментативных реакций, для идентификации НАД--зависимых бактерий, выделяемых при пневмониях и генерализованных серозитах свиней, рекомендованы в качестве основных дифференциальных признаков (кроме культуральных): НАД—зависимость, образование уреазы, щелочной фосфатазы, гемолизина, кислоты из ксилозы, маннита и маннозы. Остальные ферментативные признаки можно рассматривать как дополнительные.

Потеря культурами A.pleuropneumoniae НАД—зависимости и признание существования НАД—независимого биовара этого вида бактерий делает неприемлемой схему идентификации, предлагаемую для НАД--зависимых культур. Неизбежно расширяется число бактериальных видов, от которых необходимо дифференцировать НАД - независимые культуры A.pleuropneumoniae. Ситуация осложняется тем, что сходные патологоанатомические изменения в лёгких могут вызвать другие виды бактерий. В опытах экспериментального (интраназального) заражения свиней сходные изменения в легких были обнаружены при инокуляции культур A.pleuropneumoniae НАД—зависимого и - независимого биоваров, A.suis и бактерий «малой группы». Данное обстоятельство увеличивает значение бактериологического исследования в диагностике болезни. Сравнительное изучение физиологических свойств A.pleuropneumoniae (1 и 2 биовары), A.suis, P.multocida и B.bronchiseptica как видов сходных и достаточно часто обнаруживаемых при пневмониях свиней позволило нам отобрать для их дифференциации следующий минимальный набор признаков: липкость колоний и вязкость бульона, наличие капсулы и жгутиков, гемолитическая и уреазная активность, образование щелочной фосфатазы, индола, кислоты из маннита, сорбита, салицина, мелибиозы, утилизации цитратов.