Преципитация

1. Преципитация

Реагенты	Опытные пробы, (мл.)	Калибровочные пробы, (мл.)	Контрольные пробы, (мл.)
Сыворотка или плазма	0,15	_	_
H2O	_	_	0,15
Осаждающий реагент	0,3	0,3	0,3
Раствор холестерина	_	0,15	_

Хорошо перемешать и оставить на 10 мин при комнатной температуре. Опытные пробы отцентрифугировать в течение 10 мин при 4000g или 1-2 мин 1000g. Прозрачный супернатант использовать для определения концентрации HDL. Калибровочные и контрольные пробы центрифугировать не нужно. Определение холестерина во всех пробах в течение часа.

2. Определение концентрации HDL

Реагенты	Опытные пробы, (мл.)	Калибровочные пробы, (мл.)	Контрольные пробы, (мл.)
Супернатант	0,2	_	-
H2O+ реагент №1	_	_	0,2
Рабочий реагент для определ. холестерина	0,2	0,2	0,2
Раствор холестерина+реагент №1	_	0,2	_

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 10 мин при комнатной температуре (20-25°С) или 5 мин при 37°С и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 500 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее 2-х часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет концентрации (С) холестерина HDL проводят по формуле:

С = Е_о/Е_{ст *} 1,29 (ммоль/л) или С = Е_о/Е_{ст *} 50 (мг/100 мл) Е_о и Е_ст – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы.

2.3.6. Определение ХС-ЛОНП (холестерина-липопротеидов очень низкой плотности) расчетным методом

Уровень ХС-ЛОНП находят путем деления показателя концентрации триацилглицеринов на 2,2 (ТГ/2,2). Вывод этой формулы расчетов базируется на том, что, во-первых, при отсутствии в крови хиломикронов (а они после 12-часового голодания у большинства пациентов не выявляются) практически все количество ТГ крови сосредоточено в ЛОНП и ,во-вторых, при не слишком высокой концентрации в крови (когда содержание ТГ не привышает 4,4 ммоль/л) в частицах ЛОНП на 22 молекулы ТГ приходится 10 молекул холестерола [12].

 

2.3.7. Определение ХС-ЛНП (холестерина липопротеидов низкой плотности) расчетным методом

 Зная уровень ХС_общ плазмы, ХС-ЛВП и ХС-ЛОНП, нетрудно определить содержание ХС-ЛНП по формуле [12]:

ХС-ЛНП = ХС - (ХС-ЛВП + ХС-ЛОНП)

2.3.8. Определение индекса атерогенности (ИА) расчетным методом

Расчет индекса атерогенности призводят по формуле:

ХС_пл – £-ХС /£-ХС Х (ЭХС/СХС)

ХС_пл – общий холестерол плазмы

£-ХС (альфа-ХС) – холестерол супернатанта (ЛПВП)

ЭХС/СХС – отношение содержания эфиросвязанного и свободного холестерола супернатанта плазмы [12] .

 

2.3.9. Определение содержания диеновых коньюгатов(ДК) в эритроцитах

За основу взят классический метод Placer в модификации Гаврилова В. Б. [9] для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают в пробирках с притертой крышкой с 4 мл чистоперегнанных растворов изопропанол : гептан (1:1). Смесь встряхивают постоянно не менее одного часа затем добавляют 1 мл HCl (pH=2) после чего еще раз встряхивают две минуты, добавляют 2 мл чисто перегнанного гептана и снова встряхивают 10-15 мин. Примерно через 1-2 часа отбирают верхнюю фазу и фотометрируют при 232нм против контрольной пробы (А_фон) где вместо гемолизата взято 0,5 мл H₂O. Коэффициент экстинции при 233 нм –

2,2 * 10 ^-5 см^-1 М^-1. Формула для расчета: С(нмоль/мл эр)= (А_оп - А_фон) * 36,4

2.3.10. Определение содержания ДК в плазме крови и гомогенате печени

За основу взят классический метод Гаврилова В.Б. и соавт [9], Владимирова Ю.А. и соавт. [7]. 0,4 мл плазмы вносят в пробирку с плотной крышкой и добавляют 4 мл чисто перегнанной смеси изопропанол : гептан (1:1). Смесь встряхивают в течение 20-30 мин затем добавляют 1 мл HCl (pH=2) после чего еще раз встряхивают две минуты, добавляют 2 мл чисто перегнанного гептана и снова встряхивают 10-15 мин. Примерно через час отбирают верхнюю фазу и фотометрируют при 232 нм против контрольной пробы где вместо гемолизата взято 0,2 мл H₂O. Коэффициент экстинции 2,2 * 10 ^-5 см^-1 М^-1. Формула для расчета (при l=1 см):

С(нмоль/мл пл) = [(∆А* 10⁶)/(2,2*10⁵*1)]*[4/V_проб], где: ∆А = А_оп - А_фон, 2,2*10⁵ – коэффициент экстинции, 1 (см) = L (толщина кюветы), 2 (мл) = V_гепт (объем гептана)

 

2.3.11. Определение содержания малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах

За основу взят классический метод Ernster et al [25] в модификации для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают с 1 мл охлажденной 5% ТХУ и тщательно растирают смесь стеклянной палочкой. После выдерживают при 0±5 °С не менее 1-2 часов смесь центрифугируют при 4000 g 30 мин. Далее тщательно отбирают 0,4мл надосадка в пробирки для кипячения и добавляют 1,0 мл 0,5% тиобарбитуровой кислоты. Смесь инкубируют в кипящей воде более 10 мин после чего охлаждают и фотометрируют при 532 нм против соответствующего контроля. В расчет принимают коэффициент молярной экститнции – 1,56*10⁵ см^-1 М^-1. С(нмоль/мл эр) = ∆А * 115,8

 

2.3.12. Определение содержания МДА в плазме крови и печени

За основу взят классический метод Mihara et al. [30]. 0,4 мл плазмы крови смешивают с 4 мл охлажденной 1,4% ортофосфорной кислоты и 2 мл 0,5% тиобарбитуровой кислоты. Смесь инкубируют в кипящей бане 45 мин после чего охлаждают и добавляют 4 мл н-бутанола. Смесь встряхивают до образования белой суспензии, после чего центрифугируют при 4000 g 20 мин. Верхнюю фазу фотометрируют при 532 нм против контрольной пробы. Коэффициент экстинции – 1,56*10⁵ см^-1 М^-1. Формула для расчета (при L=1 см). С (нмоль/мл )= ∆А * 64,2

 

2.3.13. Определение жирнокислотного состава масел методом газожидкостной хроматографии (метод внутренней нормализации)

1 мл масла смешивают с 5 мл метанола, добавляют 1 мл метилирующего агента (раствор гидроксида тетраметиламмония) и 3 мл эфира серного (диэтиловый). Выдерживают в течение 10-15 мин при комнатной температуре, аликвотную часть отбирают для анализа (3-5 мкл) и хроматографируют.

Режим разделения: Температура колонки 170-190°С, Температура впрыскивающей камеры 250°С, Колонка насадочная 3 м, Содержание колонки: 5% диэтиленгликольсукцинат нанесенный на хроматон N-AW. Анализ проводят относительно количества жирных кислот.

2.3.14. Гистологический анализ

Выполняли для подтверждения наличия атеросклеротических изменений в опытных группах. Для гистологического исследования брали грудную и брюшную аорту, фиксировали 10% нейтральным формалином. Гистологическое исследование выполняли сотрудники гистологической лаборатории.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ СЕЛЕНОПИРАНА

Данные исследования антиоксидантных свойств СП по сравнению с БОТ, ТФ и СП при термическом окислении подсолнечного масла (Таблица 1) свидетельствуют о том, что антиоксидантная активность СП не уступает активности БОТ, и даже превосходит ее.

Рисунок 1

Динамика накопления пероксидов в смеси нерафинированных растительных масел в присутствии бутилокситолуола, селенопирана и токоферола

Преимущество СП становится заметным уже в течение 1-го часа окисления. Отмечено, что введение в смесь СП приводило к снижению концентрации пероксидов, и только к 6 часу их накопление достигло величин, превышающих исходные. К 26 часу окисления концентрация пероксидов в системе с БОТ составляла 95,65%, с СП – 85,51%, с ТФ – 111,6% по отношению к контролю.

Таблица 1

Динамика накопления пероксидов в подсолнечном масле в присутствии бутилокситолуола, селенопирана и токоферола

Часы	Концентрация пероксидов, ммоль/г
	контроль	БОТ	СП	ТФ
0	0,0060	0,0060	0,0060	0,0060
1	0,0090	0,0070	0,0045	0,0060
3	0,0100	0,0080	0,0055	0,0100
6	0,0131	0,0130	0,0090	0,0170
11	0,0300	0,0250	0,0210	0,0280
18	0,0480	0,0460	0,0380	0,0520
26	0,0690	0,0660	0,0590	0,0770

При щадящем режиме окисления смеси растительных масел СП в качестве АО также имел преимущества перед ТФ (Рис. 1), что позволило выбрать его для стабилизации итогового продукта – композиции нерафинированных масел льна и расторопши.

3.2. ИЗМЕНЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТКАНЕЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Результаты комплексного биохимического и гистологического анализа биоматериала, полученного от экспериментальных животных, свидетельствуют о существенном торможении развития атеросклеротических процессов при введении СМЛР в качестве добавки к ВЖР.

Достоверные различия между опытными группами обнаруживались как в количестве липидов плазмы крови, так и в их соотношении (Таблица 2). В первой опытной группе наблюдались характерные признаки нарушения липидного обмена: повышение ХС_общ на 54% и ХС-ЛНП на 350 % по сравнению с контрольной группой, на фоне снижения содержания ХС-ЛВП на 57 %. При этом ИА повышался до 6,29 по сравнению с 1,03 в контроле. Введение в ВЖР животных второй опытной группы СМЛР привело к торможению накопления в плазме ХС, снижение на 38 % и снижение концентрации ХС атерогенных ЛП: ХС-ЛНП на 272% и ХС-ЛОНП на 55% по сравнению с контролем, а также к повышению содержания ХС-ЛВП 42%, что отразилось на величине ИА – 3,91.

Таблица 2

Липидограмма плазмы экспериментальных животных

Группа	ТГ ммоль/л	ХС общ., ммоль/л	ХС-ЛВП, ммоль/л	ХС-ЛНП, ммоль/л	ХС-ЛОНП, ммоль/л	Индекс Атероген., у.е.
Контроль n=10	0,906± 0,031	1,74± 0,052	0,858± 0,024	0,459± 0,049	0,421± 0,019	1,03± 0,069
Опытная 1 n=10	0,512# ± 0,044	2,68# ± 0,083	0,372#± 0,01	2,07#± 0,08	0,240#± 0,018	6,29#± 0,393
Опытная 2 n=10	0,442#± 0,015	2,40#* ± 0,083	0,496#* ± 0,025	1,71#* ± 0,077	0,191#* ± 0,007	3,91#* ± 0,235

Примечание: * - p<0,05 относительно опытной группы 1

# - p<0,05 относительно контрольной группы

Было также установлено, что применение СМЛР существенно влияло на процессы ПОЛ. Выявлено достоверное снижение ДК плазмы на 12% , МДА эритроцитов на 37% и печени на 11% животных второй опытной группы по сравнению с животными, не получавшими СМЛР (Таблица 3).

Таблица 3

Содержание ДК и МДА в плазме, эритроцитах и печени экспериментальных животных

Группа	ДК плазмы, нмоль/мл	ДК эритроц., нмоль/мл	ДК печени, нмоль/г	МДА плазмы, нмоль/мл	МДА эритроц., нмоль/мл	МДА печени, нмоль/г
Контроль n=10	3,06± 0,097	13,2± 0,482	47,0± 1,14	11,6± 0,068	53,8± 0,914	36,7± 0,656
Опытная 1 n=10	3,24± 0,101	14,3#± 0,168	85,5#± 3,21	13,4#± 0,107	54,2± 3,30	50,6#± 1,52
Опытная 2 n=10	2,68 #* ± 0,127	16,3#* ± 0,655	87,9± 2,32	13,1± 0,051	33,9 #* ± 1,48	32,8# *± 0,362

Примечание: * - p<0,05 относительно опытной группы 1

# - p<0,05 относительно контрольной группы

3.3. ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ АОРТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Результаты гистологического исследования препаратов аорты представлены в таблице 4. При макроскопическом исследовании аорты у 100% животных первой опытной группы наблюдали умеренно выраженные уплотнения в брюшном и грудном отделе аорты и снижение эластичности стенки аорты.

При микроскопическом исследовании аорты животных первой опытной группы во всех образцах обнаружен склероз ветвей брюшной отдела у 100% с наложением фибрина у 100% и частичной облитерацией их просвета у 40 %. При исследовании грудного отдела аорты выявлены слабо выраженные очаговые утолщения стенки у 50 %. В целом в препаратах аорты наблюдали признаки атеросклероза в стадии сформированной фиброзной бляшки (Рис. 2).

Таблица 4

Макро- и микроскопические изменения стенки аорты экспериментальных животных

Признаки		Опытная 1		Опытная 2
		%	степень	%	степень
МАКРО-скопическое исследование	Уплотнения в брюшном отделе	100	++	70	+
	Уплотнения в грудном отделе	100	++	-	-
	Снижение эластичности стенки	100	++	70	+
МИКРО- скопическое исследование	Очаговые утолщения стенки в брюшном отделе	100	++	70	+
	Очаговые утолщения стенки в грудном отделе	50	+	-	-
	Наложения фибрина	100	++	-	-
	Склероз ветвей брюшной аорты	100	+++	70	++
	Облитерация просвета ветвей брюшной аорты	40	++	-	-

Примечание: +++ сильно выражены, ++ умеренно выражены, + слабо выражены

У животных второй опытной группы при микро- и макроскопическом исследовании аорты все указанные изменения были выражены в меньшей степени.

Рисунок 2

Фиброзная бляшка в стенке брюшного отдела аорты (из препаратов 1 опытной группы), окраска гематоксилин-эозин х 250.

1- грубая соединительная ткань, сформированная фиброзная бляшка

2 – нарушение целостности эндотелия.

Обнаруживались лишь начальные признаки повреждения интимы и специфические «завихрения» в слое гладкомышечных волокон, ни в одном препарате не находили сформированных «бляшек», просвет ветвей аорты свободен, а в 30% случаев (у 3-х животных) признаков атеросклероза аорты вообще не выявлено.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение СП в сочетании с ПНЖК в атерогенный рацион оказало существенное влияние на развитие атеросклеротических процессов и на процессы ПОЛ. Вероятнее всего, это связано с антиоксидантными свойствами СП.

Липидограмма плазмы эксперементальных животных более наглядно показала действие СП, так как отличия второй опытной группы от первой было значительным. Концентрация ХС_общ, ХС-ЛНП и ХС-ЛОНП второй опытной группы была достоверно ниже, чем у животных первой опытной группы. Данные изменения в липидограмме, в совокупности с повышением ХС фракции ЛВП, можно трактовать как положительные, так как ЛНП и ЛОНП являются атерогенными, а ЛВП - антиатерогенными частицами. ЛВП осуществляют обратный транспорт ХС из периферических органов и тканей в печень для окисления в желчные кислоты и выведения с желчью [14]. Этим можно объяснить более низкую концентрацию ХС_общ у животных второй опытной группы в отличие от первой. Понижение концентрации ТГ объясняется снижением количества ЛОНП, которые являются транспортной формой эндогенных ТГ [14].

При исследовании продуктов ПОЛ было выявлено достоверное увеличение концентрации ДК в эритроцитах и печени, и снижение ДК в плазме у животных, получавших СМЛР. Это объясняется тем, что вдыхание кислорода приводит к десятикратному увеличению количества перекисей в печени [18], эритроциты же осуществляют транспорт кислорода и содержат мощный катализатор ПОЛ – гемоглобин [7]. Между тем, большинство тканей в норме содержит некоторое количество липидных перекисей [17]. Так, по данным Нейфаха и Кагана в печени, мозге, сальнике крыс обнаруживается от 15 до 80 нмолей перекисей на 1 г липидов или от 1 до 4,5 нмоль перекисей на 1 г ткани [18]. Следовательно, концентрация ДК, как первичных продуктов ПОЛ, высока именно в печени и эритроцитах. Накопление ДК в клетках приводит к тому, что в мембранах появляются участки («поры»), через которые наружу выходит содержимое самих клеток и органелл, а в эритроцитах возрастает перекисный и осмотический гемолиз. ДК являются неустойчивыми и через образование липоперекисей превращаются в МДА [12]. СП взаимодействует именно с перекисями жирных кислот, причем это взаимодействие имеет двойной характер. Во-первых, в нашем исследовании была показана способность СП тормозить накопление перекисей жирных кислот, а ранее автором соединения [3] было показано, что увеличение содержания перекисей в системе приводит к рециклизации соединения, протоны расходуются на инактивацию перекисей и обрыв цепи свободнорадикального окисления. При дальнейшем разрыве ковалентных связей в системе микросомального окисления с участием ферментов цитохрома р-450 из состава СП высвобождается восстановленный селен, который участвует в образовании селеноцистеина и таким образом стимулирует синтез глутатионпероксидазы [4] – главного внутри- и внеклеточного фермента, обезвреживающего липопероксиды. Таким образом, при обрыве цепи и инактивации липопероксидов, следующая степень повреждения жирных кислот – образование МДА – не наступает, чем и объясняется достоверно более низкое содержание МДА в печени и эритроцитах у животных второй опытной группы.

По результатам гистологического анализа у животных первой опытной группы были обнаружены сформировавшиеся фиброзные бляшки в отличие от второй опытной группы, у которой были найдены только липидные пятна. Большинство морфологов считают, что развитие атеросклероза протекает по схеме: липидные пятна или полоски Ò фиброзные бляшки Òосложненные поражения (изъязвления, кальциноз, тромбоз), хотя отдельные авторы не исключают возможности образования фиброзных бляшек без предварительного формирования липидных пятен [5], но так же известно и то, что липидные пятна могут исчезнуть, если произойдет значительное и длительное снижение уровня ХС и ЛНП в плазме крови, и достигнутый уровень будет поддерживаться на протяжении полутора-двух лет у людей [14]. Важную роль в регрессии играют так же ЛВП, благодаря их способности осуществлять транспорт ХС в печень [14]. Можно предположить, что время опыта было слишком мало для того, чтобы увидеть, какие изменения произойдут с липидными пятнами во второй опытной группе, но даже полученные данные подтверждают положительное действие СМЛР. Возможно, СМЛР в сочетании с физическими нагрузками имела бы более выраженный положительный эффект, так как из-за малой подвижности у экспериментальных животных наблюдалось ожирение [14].

 ВЫВОДЫ

1. В исследованиях in vitro доказано, что селенопиран, благодаря электроно- и водорододонорным свойствам, обладает способностью тормозить накопление пероксидов в системе нерафинированных растительных масел с различным содержанием полиненасыщенных жирных кислот в большей степени, чем бутилокситолуол и токоферол.

2. Введение в высокожировой рацион экспериментальных животных смеси масел льна и расторопши с селенопираном способствует торможению атеросклеротических процессов: снижению концентрации холестерина и атерогенных липопротеидов в плазме крови, повышению содержания антиатерогенных липопротеидов.

3. Полученные данные свидетельствуют о стабилизации перекисных процессов в липопротеидах низкой и очень низкой плотности, что подтверждается положительной корреляцией между показателями содержания диеновых конъюгатов плазмы и холестерина в липопротеидах низкой и очень низкой плотности.

4. Гистологический анализ препаратов аорты подтверждает полученные биохимические данные, и свидетельствует о значительном торможении развития морфологических изменений, вызванных атерогенной диетой, при внесении в нее испытуемой смеси масел льна и расторопши с селенопираном.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.  Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. – Л.: Наука, 1985.-232с.

2.  Биохимические основы патологических процессов / Под ред. Е.С. Северина / – М.: Медицина, 2000. –304 с.

3.  Боряев Г.И., Жуков О.И., Блинохватов А.Ф., Древко Б.И. Оценка антиоксидантной активности селен органических соединений // Сб. науч. трудов Саратовского университета. – Саратов, 1996. – С.199.

4.  Боряев Г.И., Галочкин В.А., Блинохватов А.Ф. Функциональная активность монооксигеназной системы печени цыплят – бройлеров при введение в рацион селеноорганического соединения СП-1 // Бюлл.ВНИИФБиП с.-х. животных. – 1990. – Вып.3 (99). – С.70-73.

5.  Вихтер А. М. Атеросклероз // Руководство по кардиологии / Под ред. Е. И.Чазова. – М.: Медицина, 1982. – Т. 1. – С. 417 - 443.

6.  Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. - Т.29. - М., 1991. - С.1-249.

7.  Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - С.237-238.

8.  Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. - 2000. - Т.6. - №12. - С.13-19

9.  Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. // Лаб. дело. - 1983. -№3. - С.33-35.

10.  Гильмиярова Ф.Н. Патент РФ № 2131672, кл. А 23 D 9/00, 1998.

11.  Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова ЕБ. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. – М.:МАИК «Наука\Интерпереодика», 2001.-343 с.

12.  Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. В 2 т. – Минск: Беларусь, 2000. - Т.1-2

13.  Климов А.Н., Никульчева Н.Г Липиды и липопротеиды и атеросклероз. – СПб.: Питер, 1995.–298с.

14.  Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. - С-Пб: « Питер – Ком », 1999.–512с.

15.  Кравченко Ю.В. Экспериментальное исследование системы антиоксидантной защиты на этапах онтогенеза при токсическом и алиментарном воздействии: // Дис. к.б.н.-М., 2005

16.  Ланкин В.З., Вихерт А.М., Тихазе А.К. и др. Роль перекисного окисления липидов в этиологии и патогенезе атеросклероза // Вопр. мед. химии. - 1989. -№3. - С.18-24.

17.  Нейфах ЕА Биофизика. – 1971. - С.16-560.

18.  Нейфах ЕА., Каган ВЕ. Биохимия. – 1969. - С.34-511.

19.  Соколовский В.В. Тиолдисульфидное соотношение крови как показатель состояния неспецефической резистентности организма: Учебное пособие. – С-Пб., 1996.-30 с.

20.  Aviram M. Modified forms of low-density lipoprotein and atherogenesis // Atherosclerosis.-1993. - Vol.98.- P.1-9.

21.  Brown M.S., Goldstein J.L. Lipoprotein metabolism in the macrophage: implication for cholesterol deposition in atherosclerosis // Annu. Rev. Biochem. - 1983. - Vol.52.- P.223-261.

22.   Burton G., Ingold K. Vitamin E: application of the principles of physical organic chemistry to the exploration of its structure and function. // Acc. Chem. Res. – 1986. - Vol.19.- P.194 -201

23.  Cthcart M.K., Menally A.K., Morel D.W., Chisolm G.M. Superoxid anion participation in human monocyte-mediated oxidation of low-density lipoprotein and conversion of low-density lipoprotein to a cytotoxin // J. Immunol. - 1989. -Vol.142. - P1963-1969.

24.  Doba T., Burton G., Ingold K. Antioxidant and co- antioxidant activity of vitamin C. The effect of vitamin C, either alone or in the presence of vitamin E analogue, upon the peroxidation of agueous multilamellarphospholipid liposomes. // Biochem. biophys. аcta .- 1985. - Vol.835. - P.298 -303.

25.  Ernster L, Nordenbrandt K. Microsomal lipid peroxidation // Methods Enzymol., 1967. - Vol. 10. - P. 575-576.

26.  Fan Y.Y., Chapkin R.S. Importance of Dietory γ-Linolenic Acid in Human Health and Nutrition // The Journal of Nutrition. – 1998. – Vol.128. – P.1411-1414.

27.  Frenoux J-M.R., Prost E.D., Belleville J.L., Prost J.L. A Polyunsaturated Fatty Acid How us Blood Pressure and Improves Antioxidant Status in Spontaneously Hypertensive Rats // The Journal of Nutrition – 2001. – Vol.131. – Р.39-45.

28.  Halliwel B. Oxidation of low-density lipoproteins: guestions of initiation, propagation, and the effect of antioxidants // Amer. J. Clin. Nutr. - 1995. - Vol.61 (suppl). - P.670S-677S.

29.  Henning B., Chow C.K. Lipid peroxidation and endothelial cell injury: Implications in atherosclerosis. Review // Free Radical Biol. and Med. - 1988. - Vol.4. - P.99-105.

30.  Michara M., Uchiyama M., Fukuzava K. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCL4 intoxication, аnd vitamin E deficiency // Biochem. Med. 1980. - Vol. 23 (3). P. 302-311.

31.  Nair S.D., Leitch J.W., Falconer J., Gard M.L. Prevention of Cardiac Arrhythmia by Dietory (n-3) Poly un saturated Fatty Acid and Their Mechanism of Action // The Journal of Nutrition – 1997. – Vol.127. – Р.383-393.

32.  Park E., Thomas J. The mechanisms of reduction of protein mixed disulfides (dethiolation) in cardiac tissue. // Arch. Biochem. Biophys. – 1989. - Vol.274 (1). - P.47 -54.

33.  Parthasarathy S., Steiberg D., Witzturm J.L. The role of oxidized low-density lipoprotein in the pathogenesis of atherosclerosis // Annu. Rev. Med. - 1992. - Vol.43. - P.219-225.

34.  Pitas R.E. Expression of the acetyl low-density lipoprotein receptor by rabbit fibroblasts and smooth muscle cells. Up-regulation by phorbol esters // J. Biol. Chem. -1990. - Vol.265. - P.12722 -12727.

35.  Sakai M., Miyazaki A., Hakamata H. et al. The scavenger receptor serves as a route for internalization of lysophospatidilcholine in oxidized low density lipoprotein - induced macrophage proliferation // J. Biol. Chen. – 1996. - Vol.271. - P.27346 -27352.

36.  Schwarz K., Porter L.A., Fredga A. Some regularities in the structure-function relationship of organoselenium compounds effective against dietary liver necrosis // Ann.N.Y.Acad.Sci. – 1972. – Vol.14. – Р.192-200.

37.  Steinbrecher U.P., Zang H.F., Lougheed M. Role of oxidatively modified LDL in atherosclerosis // Free Radical Biol. and Med. - 1990. - Vol.9. - P.155-168.

38.  Yla-Herttuala S. Macrophages and oxidized low-density lipoprotein in the pathogenesis of atherosclerosis // Ann. Med. - 1991. - Vol.23. - P.561 -566.