ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКОГО И ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2. ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКОГО И ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

После окончания эксперимента животных выдерживали 12 часов без корма, затем наркотизировали тиопенталом натрия в дозе 6 мг на 100 г веса. После чего вскрывали брюшную полость, пунктировали брюшную аорту и собирали кровь в пробирки с гепарином, центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Готовые гемолизаты эритроцитов (разведение 1:1) и плазму затем замораживали и хранили при – 18°С- – 20°С до исследования. Затем перфузировали печень in situ через соустье полой вены охлажденным физиологическим раствором. Далее извлекали печень, промывали охлажденным физраствором, продавливали через металлический пресс с диаметром отверстий 0,2 мм и готовили гомогенаты. Печень гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком (зазор 0,18-0,2 мм) в течение 90 с при 1200 об/мин. Гомогенат хранили при –18°С- – 20°С.

Для гистологического исследования брали грудной и брюшной отдел аорты. Аорту фиксировали 10% формалином, вскрывали по длине, проводили макроскопическое исследование, далее готовили срезы методом парафиновой проводки, окрашивали гематоксилином + эозином, проводили микроскопическое исследование

2.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.3.1. Изучение антиоксидантных свойств селенопирана in vitro

Изучение антиоксидантных свойств СП in vitro проводили в системе нерафинированных растительных масел: подсолнечного, смеси масел льна и расторопши пятнистой. В модельной системе с подсолнечным маслом для сравнения использовали бутилокситолуол (БОТ) и ТФ. При этом концентрация АО (в том числе и СП) составляла 0,01% от массы. Контролем служило чистое масло. Окисление проводили при температуре 80 С, пропуская через масло воздух со скоростью 5 л/ч. Автоокисление смеси масел льна и расторопши (1:6, v/v) проводили в мягких условиях – при комнатной температуре без принудительного пропускания воздуха. СП или ТФ добавляли в смесь масел в концентрации 0,005%. Контролем служила смесь масел без АО. Количество пероксидов определяли йодметрическим титрованием [ГОСТ 26593-85].

 

2.3.2. Определение перекисного числа йодометрическим титрованием по ГОСТ 26593-85

Метод основан на окислении йодистого калия перекисями и гидроперекисями, содержащимися в образце, в растворе уксусной кислоты и хлороформа и титровании выделившегося йода раствором тиосульфата натрия.

Пробу отвешивают в колбу или пробирку, помещают навеску в колбу. Добавляют 10 см³ хлороформа, растворяют навеску, приливают 15 см³ уксусной кислоты и 1 см³ раствора йодистого калия, колбу сразу же закрывают, перемешивают содержимое в течение 1 мин и оставляют на 5 мин в темном месте при температуре 15-25°С. Затем добавляют 75 см³ воды, тщательно перемешивают и добавляют пять капель раствора крахмала. Выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия, используя раствор следующей концентрации в зависимости от предполагаемого значения перекисного числа. С (½Na₂S₂O₃) = 0,002 моль\дм³ , если перекисное число не более 6,0 моль\кг или с (½Na₂S₂O₃) = 0,01 моль\дм³, если перекисное число равно или более 6,0 моль\кг [Издательство стандартов, 1994]. Массу пробы, необходимой для измерений, в зависимости от предполагаемого перекисного числа определяют по таблице:

Предполагаемое значение перекисного числа, моль\кг	Масса испытуемой пробы, г
От 0 до 6,0	5,000-2,000
От 6,0 до 10	2,000-1,200
От 10,0 до 15,0	1,200-0,600
От 15,0 до 25,0	0,600-0,500
От 25,0 до 40,0	0,500-0,300

Для каждой испытуемой пробы выполняется два измерения. Контрольные измерения проводят параллельно с основными измерениями. Если на контрольное измерение пойдет более 0,1 см³ (0,01 моль\дм³) раствора тиосульфата натрия, то проверяют соответствие реактивов стандарту.

Вычисление результатов измерения: Перекисное число Х в миллимолях активного кислорода на килограмм пробы вычисляют по формуле

Х = (V₁-V₀)*c*1000 \ m

V₀–объем раствора тиосульфата натрия, использованный при контрольном измерении, см³

V₁ -объем раствора тиосульфата натрия, использованный при измерении, см³

C – концентрация использованного раствора тиосульфата натрия моль\дм³

1000 – коэффициент учитывающий пересчет результата измерения в ммоль\кг

m – масса испытуемой пробы, г

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных измерений.

2.3.3. Определение концентрации общего холестерина (ХС_общ) в сыворотке и плазме крови энзиматическим колориметрическим методом

ПРИНЦИП МЕТОДА. При гидролизе ЭХС холестеразой образуется свободный ХС. Образуется и имеющийся в пробе ХС: окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием (РОД) перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации в пробе.

 

Набор реагентов: CHOLESTEROL «E – D» («Vital-Diagnostics»)

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Реагенты	Опытные пробы,(мл.)	Калибровочные пробы, (мл.)	Контрольные пробы, (мл.)
Сыворотка или плазма	0,02	_	_
Физ. Раствор (H2O)	_	_	0,02
Реагент 2	2,0	2,0	2,0
Раствор холестерина	_	0,02	_

Реакционную смесь перемешивают и инкубируют не менее 5 мин при комнатной температуре (20-25°С) или при 37°С и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 500 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее 2-х часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет концентрации холестерина проводят по формуле:

С = [Е_о/Е_ст ] _* 5,17 (ммоль/л) или С =[ Е_о/Е_ст ] _* 200 (мг/100 мл)

Е_о и Е_ст – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы.

2.3.4. Определение концентрации триглицеридов (ТГ) в сыворотке и плазме крови энзиматическим колориметрическим методом

Тглицериды ^липаза глицерин + жирная кислота

Глицерин + АТФ ^{глицерокиназа} глицерил-3-фосфат +2 H₂O

Глицерил-3-фосфат + O₂^ГФО диоксиацетон фосфат +2 H₂O

H₂O₂  + 4-ААР + 4-хлорфенол ^{пероксидаза} хинонимин + 4H₂O

 Набор реагентов: TRIGLYCERIDES «E – D» («Vital-Diagnostics»)

 

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Реагенты	Опытные пробы, (мл.)	Калибровочные пробы, (мл.)	Контрольные пробы, (мл.)
Сыворотка или плазма	0,02	_	_
Физ. Раствор (H2O)	_	_	0,02
Реагент	2,0	2,0	2,0
Стандартный раствор	_	0,02	_

Реакционную смесь перемешивают и инкубируют не менее 5 мин при комнатной температуре (20-25°С) и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 505 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света. (таблица).

Расчет концентрации триглицеридов проводят по формуле:

С = [Е_о/Е_{ст *}250] – 10 (мг/100мл) или С = [Е_о/Е_{ст *}2,85] – 0,11ммоль/л

Е_о и Е_ст – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы. 10 мг/100мл (0,11ммоль/л) – поправка на содержание свободного глицерина в сыворотке (плазме крови).

2.3.5. Определение концентрации ХС-ЛВП (холестерина-липопротеидов высокой плотности) (HDL) в сыворотке и плазме крови

ПРИНЦИП МЕТОДА. Хиломикроны, липопротеиды низкой плотности (LDL) и липопротеиды очень низкой плотности (V LDL) осаждаются при добавлении к образцу фосфовольфрамат/Mg²⁺. После центрифугирования в супернатанте остаются только HDL, концентрация которых определяется так же как концентрация общего холестерина.

 Набор реагентов: HDL CHOLESTEROL «FL - E» («Vital-Diagnostics»)

 

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА