Роль оксида азота (II) в онкогенезе

1.4 Роль оксида азота (II) в онкогенезе

Оксид азота II обладает мультипотентными свойствами, определяемые как цитотоксичностью радикала, так и его коммуникативной активностью. При онкологических заболеваниях эта молекула может проявлять и противоопухолевые свойства, и участвовать в патогенезе неоплазий. NO необходим для обеспечения цитотоксического действия макрофагов на опухолевые клетки [23,42]. Выделяемый макрофагами, NO подавляет опухолевые клетки либо блокируя их железосодержащие ферменты, либо повреждая их клеточные структуры. Вызывая повреждение ДНК, NO включается в модуляцию апоптоза: активирует экспрессию p53, который вызывает задержку деления клеток в фазе G1. В то же время p53 по принципу обратной отрицательной связи подавляет синтез iNOS и таким образом предохраняет трансформированные клетки от гибели. Установлено, что синтез iNOS индуцируется TNFa. Уже через 6 – 12 ч. после действия индуктора NO достигает уровня, при котором начинает сказываться его влияние на опухолевые клетки [24,28]. NO участвует в образовании новых сосудов, что необходимо для удовлетворения потребностей раковых клеток в питании. С другой стороны, вследствие этого улучшается доставка оксида азота в опухолевые клетки. NO, выделяемая эндотелиальными или опухолевыми клетками, может стимулировать процесс инвазии в стенку сосуда, поскольку прикрепление к эндотелию сосудов необходимое звено метастазирования. Радикал обладает дезагрергирующим действием. Поэтому следует ожидать, что усиленный синтез NO подавляет межклеточное сцепление клеток в опухоли и облегчает их распространение по организму. Клеткам с минимальной продукцией NO будет труднее отделяться от первичной опухоли и образовывать метастазы. [42].

Таким образом, существуют механизмы поддерживающие баланс между участием NO как в прометастатических, так и в антиопухолевых реакциях [42].

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

Активность ферментов определяли в сыворотке крови онкологических больных. Кровь брали из локтевой вены, далее ее инкубировали 30 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 4000 g и получали сыворотку, в которой определяли активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента.

Изучение активности ферментов было проведено у 24 мужчин в возрасте от 49 до 70 лет с опухолями легких, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы. Больные подвергались химиотерапевтическому воздействию. Они составили две экспериментальные группы. Первая группа – больные до начала проведения им химиотерапии (12 человек); вторая – те же больные, но после окончания курса лечения (12 человек). В качестве контроля выступала группа из 13 здоровых мужчин такого же возраста.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Метод определения активности карбоксипептидазы N

Активность КПN определяли в сыворотке крови нингидриновым методом [61].

Опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ раствора CoSO₄, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Контрольные пробы содержали 20 мкл 100 мМ Трис-HCl, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37^oC, реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 10 мкл гиппурил-арг, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Реакцию проводили 120 мин при 37^oC и останавливали прибавлением 30 мкл 10 % трихлоруксусной кислоты.

Пробы центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, отбирали 50 мкл надосадочной жидкости, приливали 1 мл нингидринового реактива. Далее пробы встряхивали, выдерживали 12 мин на кипящей водяной бане и измеряли оптическую плотность на КФК-2 при 595 нм против H₂O.

Активность КПN определяли как разность оптической плотности опытных и контрольных проб и выражали в нмоль аргинина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка в пробах определяли биуретовым методом.

2.2.2 Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента

Активность АПФ определяли в сыворотке крови нингидриновым методом по образованию гли-арг из кбз-гли-гли-арг при рН 8,2 как активность, ингибируемую каптоприлом. Препарат фермента (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ Трис-НСl буфере, рН 8,2, или 20 мкл буфера и преинкубировали 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл раствора кбз-гли-гли-арг в вышеуказанном буфере (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты [59]. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/ мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося гли-арг нингидриновым методом [61]. Пробы колориметрировали на КФК-2 при l=590 нм. Активность АПФ определяли как разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих каптоприл. Активность фермента выражали в нмоль гли-арг, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Концентрацию белка определяли биуретовым методом.

Похожие работы

Роль карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в гемостазе у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

Скачать

69788

4

2

... раннем послеоперационном периоде. 3.  Выявлены корреляционные взаимосвязи между активностью карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента и показателями гемостаза в раннем послеоперационном периоде. 4.  Изучаемые ферменты принимают участие в процессах гемостаза у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде. Список литературы   1.  Азарян А.В. Пептидгидролазы нервной ...