Навигация
Методы количественного и качественного определения и исследования
48670
знаков
0
таблиц
4
изображения
4. Методы количественного и качественного определения и исследования
Большинством цветных химических реакций ДНК обязаны своему углеводному компоненту — дезоксирибозе. Под действием кислот ДНК легко отщепляет пуриновые основания, причем освобождается альдегидная группа дезоксирибозы. В результате дальнейшего действия кислоты дезоксирибоза претерпевает превращения с образованием w-оксилевулинового альдегида: ответственного, по-видимому, за образование окраски с реактивами на ДНК.
Чаще других реакций для обнаружения и количественного определения ДНК применяют нагревание с дифениламином в концентрированной уксусной кислоте в присутствии концентрированной серной кислоты. Эту реакцию обычно применяют в модификации Бертона (К. Burton) при 30° в присутствии уксусного альдегида. Реже применяются менее чувствительные цветные реакции с цистеином, с триптофаном или индолом, а также с карбазолом. Иногда применяют также цветную реакцию с ганитрофенилгидразином. Весьма чувствительным является флюориметрический метод, позволяющий определять до 3.10-9 г ДНК.
Для количественного определения ДНК необходимо ее предварительное отделение от РНК и (по возможности) от других веществ, мешающих применяемой реакции. Для этих целей обычно пользуются методом Шмидта и Таннгаузера (G. Schmidt, S. J. Thannhauser) в различных модификациях. Принцип метода заключается в осаждении нуклеиновых кислот вместе с белками трихлоруксусной или хлорной кислотой, отмывании кислоторастворимых фосфорных соединений, экстрагировании липидов и извлечении нуклеиновых кислот при помощи гидролиза 5% трихлоруксусной кислотой при 90° в течение 15—20 мин. Белки при этом остаются в осадке; из раствора, содержащего нуклеиновые кислоты и подвергнутого гидролизу 0,3— 1,0 н. щелочью, вызывающей распад РНК до нуклеотидов, ДНК осаждают подкислением трихлоруксусной или хлорной кислотой. Осадок отмывают и ДНК экстрагируют горячей хлорной кислотой. Содержание ДНК определяют по фосфору, спектрофотометрически или при помощи специфических цветных реакций, но спекислотрофотометрический метод является наиболее простым и быстрым для определения ДНК после отделения ее от других веществ, характеризующихся максимумом поглощения при 260 нм.
При определении нуклеотидного состава ДНК последнюю подвергают гидролизу хлорной кислотой и отщепившиеся пуриновые и пиримидиновые основания разделяют хроматографией на бумаге или на ионообменниках. Хорошие результаты дает также хроматография в тонком слое на производных целлюлозы и др. Поскольку в обычных двуспиральных ДНК нуклеотидный состав подчиняется определенным правилам (правила Чаргаффа), он может быть выражен в виде процентного содержания ГЦ-пар. Молярный процент ГЦ-пар вычисляют, используя температуру плавления ДНК (температура, при которой денатурирована половина ДНК), по формуле: процент ГЦ-пар = 2,44 ((°пл — 69,3°). Коэффициенты, приведенные в формуле, рассчитаны эмпирически и варьируют в зависимости от ионной силы, ионного состава и величины рН раствора. Хорошие результаты при определении нуклеотидного состава ДНК дает метод улътрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Плавучая плотность ДНК при этом линейна связана с молярным содержанием ГЦ-пар (изменение содержания ГЦ-пар на 1% изменяет плавучую плотность на 0,001 единицы) и определяется по уравнению: молярное содержание ГЦ-пар = 10,2 .(р — 1,660), где р — плавучая плотность исследуемого препарата ДНК. Для чистых препаратов ДНК нуклеотидный состав можно определить также по спектру поглощения в 0,1 М уксусной кислоте по формуле, предложенной Фредериком (Е. Fredericq).
5. Содержание в клетках и тканях
Содержание ДНК в органах и тканях животных и человека колеблется в широких пределах и, как правило, тем выше, чем больше клеточных ядер приходится на единицу массы ткани. Особенно много ДНК (около 2,5% сырого веса) в вилочковой железе, состоящей главным образом из лимфоцитов с крупными ядрами. Довольно много ДНК в селезенке (0,7—0,9%), мало (0,05—0,08%) в мозге и мышцах, где ядерное вещество составляет значительно меньшую долю. На ранних стадиях эмбрионального развития в этих органах содержится больше ДНК, но содержание ее уменьшается в процессе онтогенеза по мере дифференцировки. Однако количество ДНК на одно клеточное ядро, содержащее диплоидный набор хромосом, практически постоянно для каждого биологического вида. Соответственно количество ДНК в ядрах половых клеток вдвое ниже. По этой же причине различные физиологические и патологические факторы почти не влияют на содержание ДНК в тканях, а при голодании, например, относительное содержание ДНК даже возрастает за счет снижения концентрации других веществ (белков, углеводов, липидов, РНК). У всех млекопитающих количество ДНК в диплоидном ядре почти одинаково и составляет около 6 1012 г, у птиц — около 2,5 10-12, у разных видов рыб, амфибий и простейших оно колеблется в значительных пределах.
Содержание ДНК в бактериях довольно велико и достигает нескольких процентов в пересчете на сухой вес; в вирусах оно может доходить до 50%. Вместе с тем абсолютное количество ДНК в бактериальной клетке в среднем на два порядка ниже, чем в клеточном ядре высших организмов, а в ДНК-содержащих вирусах оно ниже еще на два порядка.
У бактерий одна гигантская молекула ДНК образует генофор, соответствующий хромосоме высших организмов. Так, у кишечной палочки Escherichia coli молекулярный вес такой кольцеобразной двуспиральной молекулы достигает около 2,5-Ю9 и длины, превышающей 1,2 мм. Эта огромная молекула плотно упакована в небольшой «ядерной области» бактерии и соединена с бактериальной мембраной.
В хромосомах высших организмов (эукариотов) ДНК находится в комплексе с белками, главным образом гистонами; в каждой хромосоме содержится, по-видимому, одна молекула ДНК длиной до нескольких сантиметров и молекулярным весом до нескольких десятков миллиардов. Такие огромные молекулы умещаются в клеточном ядре и в митотических хромосомах длиной в несколько микрометров. Часть ДНК остается не связанной с белками; участки несвязанной ДНК перемежаются с блоками ДНК, связанной с гистонами. Показано, что в таких блоках содержится по две молекулы гистонов 4 типов: Нда, Hab, Hg и Н4.
Помимо клеточного ядра, ДНК содержится в митохондриях и в хлоропластах. Количество такой ДНК обычно невелико и составляет небольшую долю общей ДНК клетки. Однако в ооцитах и на ранних стадиях эмбрионального развития животных подавляющая часть ДНК локализована в цитоплазме, главным образом в митохондриях. В каждой митохондрии содержится по поскольку молекул ДНК. У животных мол. вес митохондриальной ДНК составляет около 10-106; ее двуспиральные молекулы замкнуты в кольцо и находятся в двух основных формах: сверхскрученной и открытой кольцевой. В митохондриях и в хлоропластах ДНК не находится в комплексе с белками, она ассоциирована с мембранами и напоминает бактериальную ДНК Небольшие количества ДНК обнаружены также в мембранах и некоторых других структурах клеток, однако их особенности и биологического роль остаются неясными.
Похожие работы
... методы составления генетических карт. 1. Перенос генетического материала у актиномицетов 1.1 Перенос генетического материала с помощью плазмид Это наиболее часто встречающийся способ переноса генетического материала у актиномицетов. Линейные плазмиды актиномицетов были обнаружены раньше, чем линейные хромосомы. Впервые они были описаны у одного из видов актиномицетов в конце 70-х – начале ...
... : генный, хромосомный и геномный. На каждом из них проявляются основные свойства материала наследственности и изменчивости и определенные закономерности его передачи и функционирования. 4. Генный уровень организации генетического аппарата Элементарной функциональной единицей генетического аппарата, определяющей возможность развития отдельного признака клетки или организма данного вида, ...
... , либо переобогащение альфоидными последовательностями из области центромеры. Внутренние делеции описаны также другими авторами. 4. Перенос генов, опосредованный ДНК 4.1 Введение В настоящее время разработано большое количество методов для введения клонированных последовательностей ДНК в клетки млекопитающих. Среди них преципитация фосфатом кальция или DEAE-декстраном, электропробой, ...
... сходство хромосом по сравнению с другими клеточными органеллами к основным красителям. В течение последующих 10 – 15 лет большинством биологов было подтверждено, что именно хромосомы служат материальным носителем наследственности. Хромосомы особенно четко видны во время делений клеток, однако факт непрерывности их существования и в неделящихся ядрах сомнений не вызывает. Основная особенность ...
0 комментариев