Методы исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методы отбора проб

Почвенный образец берут стерильным буром, стерильной лопаткой и стерильным ножом в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную банку, закручивающуюся пробкой, обернутой стерильной ватой, либо в стерильные полиэтиленовые или пергаментные мешки. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия проб, горизонта и других сведений. Бур, лопату и нож перед взятием образца тщательно очищают, затем обжигают горящим спиртом (Теппер ,1987).

Почвенные образцы анализируют в первые сутки. В случае необходимости допускается хранение их в холодном помещении (в холодильнике) в течение двух дней. Для большей однородности среднего образца, соблюдая все правила асептики, его тщательно перемешивают, вынимают корни растений, различные включения (Теппер ,1987).

Для дальнейшего исследования отобранных проб, предварительно необходимо произвести стерилизацию микробиологической посуды и сред, используемых в последующей работе.

2.2.2 Методы стерилизации

Стерилизация или обеспложивание (от лат. sterilis - бесплодный), это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.

Известно несколько методов стерилизации. Чаще всего применяют стерилизацию нагреванием.

1. Фламбирование, или прокаливание.

Прокаливать можно непосредственно перед употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные, покровные стекла и т.д.

 2. Стерилизация сухим жаром

Ее применяют для обработки посуды и сухих материалов. При этом стерилизуемый объем выдерживают при170◦C в течение 2 часов в печи Пастера или в электросушильных шкафах. Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают ватными пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пипетки, заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых посуда может хранится после стерилизации (Теппер,1987).

3. Стерилизация текучим паром.

Текучим паром (100◦C) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко), Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 мин. в течение 3 суток ежедневно. Такая стерилизация называется дробной.

4.Стерилизация насыщенным паром под давлением.

Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые ссоры. С его помощью стерилизуют большинство питательных сред, посуду.

Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающимся толстостенном котле – автоклаве. (Теппер,1987).

2.2.3 Приготовление почвенной суспензии и посев. Приготовление разведений

Численность популяций микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физрастворе. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды - это 1-е разведение, 10ˉ¹. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку - получают 2–е разведение. Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведений зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата (Методические указания по количественному учету микроорганизмов, 2004).

 Техника посева. В чашки Петри посевы могут быть произведены двумя способами: глубинным посевом или рассевом по поверхности питательной среды. При первом методе в стерильную чашку Петри вносят или исследуемую воду, или разведение грунта, или разведения культуры и заливают расплавленным и охлажденным до 40-45◦C агаром. Как при внесении посевного материала, так и при заливании его агаром крышка чашки Петри приподнимается как можно меньше (Родина ,1965).

2.2.4 Учет микроорганизмов на плотных средах

После инкубации засеянные среды вынимают из термостата и в них подсчитывают число колоний.

При подсчете колоний на богатых плотных питательных средах (МПА, МПА+сусло-агар, КАА, сусло-агар, среда Чапека, Среда Эшби и т.д.) закрытые чашки Петри просматривают в проходящем свете и с внешней стороны их колонии отмечают маркером. Если на чашке больше 200 колоний, то их можно подсчитывать с помощью камеры Вольфюгеля. Учет микроорганизмов на МПА делают визуально на четвертый день после посева, проводя микроскопирования и подсчитывая ОМЧ (Теппер,1987).