Замораживание – оттаивание/обработка ультразвуком

3.         Замораживание – оттаивание/обработка ультразвуком.

Эта методика, однако, применяется нечасто из-за опасности денатурации белка. Иногда для облегчения реконструкции используют простую обработку ультразвуком. Вероятнее всего, белок вначале включается в маленькие везикулы, обладающие высокой кривизной. Замораживание – оттаивание, возможно, нужно для слияния мелких протеолипосом в более однородные по размерам.

Реконструкция с использованием детергентов

В настоящее время для реконструкции используют методики, состоящие в солюбилизации смеси белка и фосфолипида детергентом и последующем удалении детергента. После его удаления белок и фосфолипид спонтанно формируют однослойные везикулы, вполне пригодные для энзимологических исследований. Обычно выбирают детергенты с высокой критической концентрацией мицеллообразования и малыми размерами мицелл, с тем, чтобы их можно было легко удалить диализом или гель-фильтрацией. Чаще всего используют холат натрия и октилглюкозид. В качестве примеров можно привести встраивание цитохром с-оксидазы и Na⁺/K⁺-ATPазы.

С помощью такой методики можно ввести в везикулы отличные от фосфолипидов вещества, например холестерол или убихинон. В ряде случаев возникает необходимость в достаточно быстром удалении детергента, особенно если белок нестабилен при его избытке. Тогда применяют гель-фильтрационную хроматографию, тоже позволяющую эффективно отделить белково-липидные везикулы от детергента (например, при реконструкции глицеро-3-фосфатацилтрансферазы и фосфатидилинозитолсинтазы)

Ещё более быстрым является метод разведения, когда белково-липидно-детергентную смесь разводят до концентрации детергента много меньшей, чем критическая концентрация мицеллообразования. При этом спонтанно образуются белково-фосфолипидные везикулы, которые можно отделить от детергента центрифугированием.

Обычно используемый для отчистки мембранных ферментов тритон Х-100 весьма неудобен при реконструкции, поскольку его трудно удалить из системы. Для удаления тритона применяют шарики из полистирола, и одна из проблем – потеря белка из-за его сорбции на поверхности шариков. В качестве примера белка, реконструируемого этим методом, можно привести натриевый канал.

И наконец, для реконструкции применяли метод, основанный на диспергировании смеси холестерол-фосфолипид-белок в диэтиловом эфире и последующем испарении обращённой фазы.

4.         Регуляция активности мембраносвязанных ферментов

Мембранные ферменты отличаются от растворимых ферментов одним важным свойством: все они прочно связаны с липидным бислоем соответствующих мембран. Поэтому помимо субстратов, активаторов или ингибиторов их регуляторами являются сами мембранные липиды. Липиды при этом могут выполнять две функции: 1) создавать необходимую среду; 2) действовать как аллостерический регулятор, модулирующий активность фермента. В первом случае липиды не только предотвращают денатурацию ферментов друг с другом и с прочими мембраносвязанными компонентами, в частности с липофильными субстратами. В качестве аллостерических эффекторов липиды обычно активируют фермент преимущественно путём стабилизации его в определённой стабилизации. В идеальной экспериментальной системе аллостерическим эффектором должен быть специфический липид, а необходимое для работы окружение фермента должно создаваться всей основной массой липидов в бислое. К сожалению, пока обнаружен только один пример абсолютной специфичности фермента к определённому липиду. β-Гидроксибутиратдегидрогеназе для проявления каталитической активности необходим именно фосфатидилхолин, а в большинстве случаев ферменты достаточно эффективно активируются различными липидами. На ферментативную активность может влиять также физическое состояние бислоя, в частности поверхностная плотность заряда и вязкость. Изменение физического состояния бислоя может влиять на взаимодействие с ферментом любых липидов, в том числе и тех, которые функционируют как аллостерические эффекторы.

Для исследования влияния липидов на мембранные ферменты применяется метод смешанных мицелл. Фермент растворяют в детергенте, не активирующем его, и к смеси добавляют липиды. Многие мембранные ферменты сохраняют определённую активность и в детергенте, причём такая активность сильно зависит не только от природы фермента, но и от выбранного детергента, а также, возможно, от наличия эндогенных липидов в препарате очищенного фермента. Для метода смешанных мицелл желательно полностью освободить фермент от липида. Методы полного обезжиривания обычно основаны на пропускании препарата фермента через среду с большим избытком детергента. Для этого используют гель-фильтрацию, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы или связывание фермента с каким-либо твёрдым носителем (например, ДЭАЭ-сефарозой) с последующим промыванием избытком детергента.

Метод смешанных мицелл имеет ещё и то преимущество, что липофильный субстрат можно добавить в мицеллах того же детергента, хотя в этом случае могут возникнуть трудности, связанные с пространственным разделением фермента и субстрата. К сожалению, физическое состояние комплекса фермент-детергент-фосфолипид определить практически невозможно, и это серьёзный недостаток описываемого подхода.

Результаты исследования многих систем позволяют сделать несколько общих выводов.

1.         Для активации фермента очень редко бывает необходим липид с какой-то строго определённой структурой. Одни липиды активируют данный фермент с большей эффективностью, чем другие, однако такое предпочтение может зависеть от условий измерения. Может оказаться, что липид, с высокой эффективностью активирующий фермент, вообще не присутствует в мембране, из которой этот фермент выделен.

2.         Измеряемая в системе со смешанными мицеллами зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации липида обычно свидетельствует о высокой кооперативности процесса. Такое поведение можно объяснить, в частности, тем, что липиды связываются некооперативно с несколькими эквивалентными центрами на ферменте, но активными являются только те молекулы фермента, у которых занята большая часть липидсвязывающих центров.

3.         Сама по себе бислойная структура не является необходимой для активации ферментов, поскольку многие ферменты проявляют активность в присутствии детергента или в составе липидно-детергентных мицелл.

4.         Важным параметром, определяющим активность большинства мембранных ферментов, безусловно, является физическое состояние бислоя. При переходе липидов в фазу геля многие ферменты становятся неактивными либо их активность резко уменьшается. Выявить связь ферментативной активности с вязкостью мембраны, исходя из температурной зависимости, весьма непросто, поскольку температура влияет одновременно на очень многие параметры. Следует иметь в виду, что вязкость мембраны в значительной степени коррелирует с плотностью упаковки молекул липида в бислое, индуцируемые температурой изменения вязкости можно объяснить в основном изменениями в плотности упаковки. Липиды могут сильно влиять не только на максимальную скорость, но и на связывание фермента с субстратами и кофакторами.

5.         Вообще говоря, при исследовании взаимодействия с определенным ферментом большого числа разных липидов корреляции между активностью фермента и каким-либо одним параметром (например, вязкостью) не наблюдается. Пока липид находится в жидкокристаллическом состоянии, для ферментативной активности часто более важна структура полярной головки липида, чем вязкость бислоя. Другими словами, важна химическая структура индивидуальных липидов.

Заключение

Мембранные ферменты в составе бислоя приобретают большую стабильность и способность к осуществлению реакций, которые в гидрофильном окружении протекали бы с весьма малой скоростью. Липидное окружение предоставляет таким белкам «привилегированные» условия функционирования, но и накладывают ограничения на поведение белковых ассоциатов: последнее сильно зависит от плотности упаковки мембран. Интерпретировать данные по влиянию липидов на активность изолированных мембранных ферментов часто очень непросто. Изучение очищенных мембранных белков ставит перед исследователем огромное множество совершенно особых проблем, не встречающихся при работе с растворимыми ферментами.

Литература

1.       Р. Геннис. Биомембраны.– Москва: «Мир», 1997. – 624с.

2.      С.В. Гринштейн, О.А. Кост. Структурно-функциональные особенности мембранных белков. – Москва: МГУ, 104с.

3.      С.Е. Северин, Г.А. Соловьёва. Практикум по биохимии. – Москва: Изд-во МГУ, 1989. – 509с.

4.      Б.Ф. Коровкин, Т.Т. Берёзов. Биологическая химия. – Москва: «Медицина», 1998. – 704с.