Навигация
1. Введение
История развития методов биохимических исследований. Роль методического обеспечения в развитии биохимии. Классификация методов исследования в биохимии. Применение биохимических методов в медицине, биотехнологии, экологии и др. отраслях
2. Методы препаративной химии и биохимии
Особенности биологических макромолекул как объектов исследования: высокая молекулярная масса, денатурация, полиэлектролитная природа, низкая скорость диффузии.
Оборудование биохимической лаборатории, специальные материалы и реактивы. Отделение осадков и нерастворимых веществ. Центрифугирование. Ультрафильтрация. Некоторые приемы, используемые при работе с белковыми растворами. Диализ.
Разделение белков путем осаждения. Общие положения. Растворимость белков при низкой концентрации солей. Высаливание при высокой концентрации соли. Осаждение белков органическими растворителями. Осаждение белков органическими полимерами и другими веществами. Осаждение вследствие избирательной денатурации. Осаждение нуклеиновых кислот. Кристаллизация белков.
3. Методы выделения органелл
Приготовление экстракта. Исходный материал. Особенности различных видов живых организмов в качестве исходного материала биохимических исследований. Свежесть сырья и его хранение.
Разрушение клеток и экстракция. Способы разрушения клеток. Растворы, используемые для экстракции. Буферные растворы и специальные добавки. Оптимизация и осветление экстракта. Особенности приготовления экстрактов растительных тканей и микроорганизмов.
Методы, используемые при очистке белков, ассоциированных с частицами. Детергенты и их применение.
4. Методы дифференциального центрифугирования
Центрифуга, ее устройство. Силы, действующие на частицу в роторе центрифуги. Скорость осаждения частиц. Константа седиментации. Раздельное осаждение частиц. Дифференциальное центрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности. Методы получения ступенчатых и непрерывных градиентов плотности.
5. Хроматография
5.1. Классификация и элементы теории хроматографии
Классификация хроматографических методов. Классификация по принципу фракционирования. Классификация по способу элюции. Классификация по расположению неподвижной фазы.
Элементы теории хроматографической элюции. Хроматографический процесс. Хроматографическая зона. Концепция теоретических тарелок. Кинетическая теория хроматографии. Разрешение близко мигрирующих зон. Оптимизация условий фракционирования. Градиентная элюция. Хроматография макромолекул.
5.2. Материалы матриц сорбентов и обменников
Целлюлоза. Гели на основе декстрана (сефадексы). Агароза. Полиакриламидный гель. Сефакрилы. Ультрогели. Полистирольные смолы. Полиамидные смолы. Кизельгур (целит, диатомовая земля). Силикагель. Окись алюминия. Пористое стекло. Оксиапатит.
5.3. Техника колоночной хроматографии
Хроматография при низком давлении. Хроматографические колонки. Резервуары для элюента. Смесители. Внесение препарата в колонку. Перистальтические насосы. Детекторы. Коллекторы фракций. Вспомогательное оборудование.
Хроматография при высоком давлении. Колонки. Внесение препарата. Задание градиента элюции. Детекторы.
Хроматография при умеренном давлении.
5.4. Гель-фильтрация
Общая характеристика метода. Принцип метода. Коэффициенты распределения. График селективности. Эффективность фракционирования.
Характеристика продажных матриц.
Методические особенности гель-фильтрации при низком давлении. Подготовка матрицы. Набивка колонки. Проверка качества набивки. Определение V0. Внесение препарата. Поддержание рабочего режима. Регенерация колонки.
Выбор параметров хроматографического процесса. Выбор матрицы. Размеры колонки. Выбор элюента. Скорость элюции. Оптимизация условий эксперимента.
Области применения. Очистка и фракционирование макромолекул. Определение молекулярной массы белка. Обессоливание и смена буфера.
Гель-фильтрация при высоком давлении. Гель-фильтрация в тонком слое.
5.5. Распределительная хроматография
Принцип метода. Нормальнофазовая распределительная хроматография. Распределительная хроматография в обращенных фазах.
Обратнофазовая гидрофобная хроматография при низком давлении. Немодифицированная сефароза. Элюция снижающимся градиентом концентрации соли. Гидрофобизированные гели агарозы.
Распределительная хроматография при высоком давлении.
5.6. Адсорбционная хроматография
Принцип метода. Сорбенты. Приготовление оксиапатита. Сорбционные свойства оксиапатита. Сорбция белков. Сорбция нуклеиновых кислот. Некоторые особенности хроматографии на оксиапатите. Фракционирование и очистка белков. Фракционирование и очистка нуклеиновых кислот. Разделение двунитевой и однонитевой ДНК. Очистка гибридов ДНК-РНК.
5.7 Ионообменная хроматография
Принцип метода. Компоненты хроматографической системы. Ионообменники. Элюент. Хроматографируемые вещества. Хроматографический процесс. Ионные взаимодействия вещества и сорбента. Управление силой ионного взаимодействия. Неионные взаимодействия вещества и сорбента.
Характеристики продажных ионообменников.
Подготовка обменников к набивке в колонку. Преформирование и промывка. Перевод в нужную ионную форму. Опасность поглощения СО2.
Применение статической ионообменной хроматографии. Нейтрализация щелочи или кислоты без образования соли. Замена ионов. Обессоливание растворов. Удаление некоторых органических примесей. Концентрирование препаратов. Разделение компонентов смеси, сильно различающихся сродству к обменнику.
Выбор условий динамической ионообменной хроматографии. Выбор ионообменника. Выбор типа элюции. Выбор рН буфера для элюции. Выбор концентрации соли. Сохранение нативности препарата. Выбор объема элюента. Выбор размеров колонки. Выбор скорости элюции. Сбор и обработка фракций. Регенерация ионообменника.
Применение динамической ионообменной хроматографии.
Ионообменная ЖХВД белков.
Хроматофокусирование. Принцип метода. Колонки для хроматофокусирования. Фракционирование белков.
Похожие работы
... на основе электрофоретической мобильности и высокая специфичность иммунных антисывороток. Лекция 16. Принцип иммунного электрофореза. Иммунофиксация Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) - это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута сыворотка крови, моча, спинномозговая или ...
... заболевания. Определение маркеров опухолей хотя и дорогой, но очень важный метод исследования, без которого в ряде случаев обойтись просто невозможно. Большинство лабораторных методов исследования требуют специального оборудования. Так, для подготовки и сохранения проб при заданной температуре, а также проведения бактериологических и серологических исследований используют термостаты, а также ...
... часто используют одновременно, что значительно расширяет возможности физиологических экспериментов. Эти системы можно комбинировать в различных вариантах. ЭЛЕКТРОДЫ В физиологических исследованиях электроды являются связующим звеном между объектом исследования и приборами. Они применяются для нанесения разряжения или регистрации (отведения) биоэлектрической активности клеток, тканей и ...
... к естественным, а также позволяет формировать требуемые начальные и текущие условия эксперимента и эффективный контроль в течение заданного промежутка времени [3, 6, 13]. Созданная нами модель водной экосистемы включает элементы концептуальной и имитационных моделей. Имитационные модели - это уменьшенные копии отдельных подсистем; концептуальные модели представляют собой блоковые схемы воздействия ...
0 комментариев