1.4 Использование микроорганизмов в токсикометрии
Использование в качестве аналитических индикаторов микроорганизмов нередко является единственно надежным методом определения малых количеств веществ, так как основано на прямом воздействии химического вещества на живую клетку. Ответная реакция микробной культуры на изменение состава среды представляет собой среднее из показателей миллионов отдельных организмов, что обеспечивает наиболее объективные и достоверные результаты.
Однако микробиологические методы недостаточно разработаны как методически, так и в плане инструментального обеспечения. Растущие масштабы их применения для решения разнообразных аналитических задач в медицине, экологии, в фармацевтической, пищевой и парфюмерной промышленности, а также в системе лабораторий, контролирующих качество природных и сточных вод (Nicolas, 1966; Koch et al., 1964; Kavanagh, 1963; Brown et al., 1976) требуют современного аппаратурного оснащения и автоматизации. В связи с этим интересно рассмотреть индикаторные свойства микроорганизмов с точки зрения способов трансформации их в аналитический сигнал, регистрируемы и с привлечением технических средств.
Под действием химических веществ различных концентраций могут изменяться морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов. Например, в присутствии сублетальных концентраций катионов тяжелых металлов изменяются почти все перечисленные свойства микробных клеток, их форма, размеры, ослабляются ростовые процессы, понижается ферментативная активность, интенсивность дыхания (Сенцова и др.,1985). Под действием Ni2+ на морскую бактерию Artrobacter тariпиs значительно увеличиваются размеры клеток: при концентрации Ni2+4*10-4 моль объем их за 4.5 ч возрастает в 250 раз (Gobet et al., 1970). В процессе роста бактерий и дрожжей на среде, содержащей медь, размеры клеток уменьшаются (Авакян, 1973). В присутствии комплексных ионов платины клетки Е. coli приобретают нитевидную форму (Rosenberg et al.,1967).
Многие токсические вещества вызывают появление у бактерий слизистой капсулы, предохраняющей клетку от гибели. Под действием фенола, этилового спирта утрачивается подвижность клеток бактерий рода Proteus (Нестерова, 1972). Регистрируют морфологические изменения путем микроскопирования препаратов живых или фиксированных клеток с помощью электронного микроскопа. Предложено также дополнительное устройство, содержащее ряд камер и позволяющее наблюдать за развитием микроорганизмов в проточных питательных средах высокоапертурными объективами микроскопов (Гашинский, 1973).
Способы регистрации информации, получаемой с помощью микробиологических методов многообразны. Они включают визуальные, приборные и математические методы. На визуальной оценке результатов основаны полуколичественные методы определения антибиотиков (Сиволодский, 1974), латекса трибутилоловосодержащего сополимера АБП-10П, метода оценки токсичности сточных вод. Полуколичественный метод определения оловоорганического соединения АБП-10П разработан учеными (Туманов и др., 1998) на основе регистрации ростовых реакций трех различных по чувствительности штаммов бактерий B. laterosporus, B. pumilis 732 и Sarcina lutea (Туманов и др., 1988). Он позволяет определять нерастворимые в воде соединения (без предварительного их разложения) в диапазоне концентраций 2-40 мкг/мл. Метод оценки токсичности сточных вод (Павленко и др., 1988) с использованием условно прототрофного штамма Saccharomyces cerevisiae дает возможность количественно характеризовать токсико-генетическое действие промышленных сточных вод путем регистрации цитостатического и летального эффектов.
При качественном обнаружении и количественном определении биологически активных веществ часто принимают во внимание зависимость культуральных свойств микроорганизмов от химического состава среды. К ним относятся различные ростовые реакции: стимуляция или ингибирование роста в зависимости от концентрации определяемого вещества и связанные с ними изменения численности клеток, продолжительности отдельных фаз роста, динамики накопления биомассы, размеров бактериальных колоний, характера их поверхности и пигментации (Рубенчик, 1972; Глухова, 1980).
Наиболее простым и широко распространённым способом регистрации ростовых реакций микробных культур является измерение диаметра и площади зон угнетения или стимуляции роста бактерий при выращивании их на плотных средах. Этот принцип положен в основу методов определения многих антибиотиков и витаминов (Егоров, 1965). Он реализован при разработке метода определения трилана (4,5,6-трихлорбензоксизалинона-2), используемого для защиты бумаги и изделий из нее от биоповреждений (Туманов и др., 1982). В качестве аналитического сигнала использована ростовая реакция бактерий Bacillus mesentericus 5 Trevisan, характеризующихся повышенной чувствительностью к трилану и устойчивостью в щелочной среде. Диаметр зоны угнетения роста тест-культуры в растворе 0,1 М КОН пропорционален логарифму концентрации указанного соединения. Предложенный способ позволяет определить трилан в диапазоне концентраций от 5 до 100 мкг в 0,1 мл раствора, а также в бумаге.
Для определения этилмеркурхлорида в качестве аналитических индикаторов использовали культуры гриба Aspergillus niger и дрожжей Torula candida, регистрировали их ростовую реакцию измерением площади зон подавления роста. Предел обнаружения – 0,1 мкг/мл, относительная погрешность метода – 10% (Туманов и др.,1982).
Изменения численности микробных клеток под действием биологически активных веществ часто фиксируют с помощью турбидиметрических методов, измеряя оптическую плотность жидкой культурной среды, в которой выращивают микроорганизмы, с помощью фотоэлектроколориметра или нефелометра.
Метод определения загрязнённости вод, описанный в (Потапова и др., 1988), основан на ингибировании роста культур водных бактерий и позволяет оценивать качество сточных вод, содержащих сернокислую медь в концентрации 1×10-3 мг/л и более, смесь пестицидов пропанида и сатурна в концентрациях 5×10-5 и 1×10-3 мг/л, смесь фенола и формальдегида в концентрациях 5×10-2 и 1×10-2 мг/л, соответственно.
Одним из культурных свойств бактерий является способность к образованию пигментов, которая утрачивается при отсутствии в среде некоторых элементов. На этом основан визуальный способ качественного обнаружения катионов железа, меди, магния и некоторых других элементов (Месробяну и др., 1963).
Отклик микроорганизмов на изменение химического состава среды выражается не только в интенсивности процессов воспроизводства (размножения) или ростовых реакциях, но и в разнообразных физиолого-биохимических реакциях.
В качестве аналитического сигнала могут быть использованы термограммы микроорганизмов. В работе (Monk, 1978) приведены доказательства зависимости количества тепла, выделенного микробными клетками, от химического состава среды.
Объективным показателем содержания в среде токсичных примесей могут служить активность данного микроорганизма, которая изменяется в зависимости от концентрации отдельных веществ.
В последние годы для аналитических целей стали использовать люминесцентные свойства светящихся бактерий, принадлежащих к роду Photobacterium и Beneckea. Биолюминесцентный анализ основан на специфических реакциях с высоким квантовым выходом, позволяющих применять их для определения многих биологических активных веществ.
Показана возможность использования светящихся бактерий для определения фенольных компонентов сточных вод (Данилов и др.,1988). В качестве токсинов использовали типичные представители фенолов сточных вод: монофенолы, резорцин, гидрохинон и продукты его окисления н-бензохинон.
Биологический метод анализа может основываться не только на подавлении жизнедеятельности живых организмов. Перспективным приёмам повышения чувствительности этого метода является использование биологического концентрирования. Процесс биологического концентрирования использовали для выделения малых концентраций жизненно-необходимых катионов из разбавленных растворов (Постнов и др., 2000). В качестве аналитического индикатора применён плесневый гриб Aspergillus niger, выращенный на питательном растворе, содержащем определённые количества катионов железа, меди или цинка. Показателем содержания катионов в растворе служила биомасса гриба и данные последующего спектрального определения их в биомассе после высушивания и минерализации. Установлены уровни концентраций катионов, подавляющих рост культуры гриба; они в десятки раз превышают концентрации, стимулирующие её рост. Таким образом, включение в аналитический арсенал методик, основанных на стимуляции роста индикаторных организмов, расширяет границы традиционного биотестирования, значительно повышает чувствительность биологического метода анализа.
Обобщая приведенные данные, касающиеся особенностей микробиологических методов определения токсических веществ, следует отметить многообразие ответных реакций микробных культур на воздействие химических элементов и соединений и разнообразие способов их трансформации в аналитический сигнал. Выбор наиболее эффективных из них зависит от механизма и глубины воздействия вещества на индикаторный организм, что, в свою очередь, определяет чувствительность и избирательность биометода (Туманов, 1998).
В зависимости от целей анализа возможны как визуальные, так и инструментальные способы оценки и регистрации информации, получаемой с помощью микробиологических методов. При контроле химических загрязнений водной среды и анализе их состава предполагается использование специальной аппаратуры типа ферментеров-хемостатов, турбидостатов. В них автоматически поддерживается режим культивирования по основным параметрам среды (растворенный кислород, температура, рН среды, плотность микробной культуры) (Mitruka et al., 1975; Крайнюкова, 1988). Чувствительные и надежные токсикогpафы для регистрации аналитического сигнала позволяют избежать субъективных ошибок и повысить воспроизводимость результатов.
Перспективны в развитии микробиологических методов биоаналитические устройства – биосенсоры, содержащие иммобилизованные клетки микроорганизмов и обеспечивающие контакт определяемым веществом. Их составной часть являются преобразователи биохимической или ростовой реакции микробного индикатора в аналитический сигнал. В этом случае биологический объект выступает в роли первичного источника информации, которая затем воспринимается находящимся в непосредственной близости вторичным – физическим датчиком.
Современные способы быстрого контроля токсических загрязнений природных и сточных вод предусматривают введение биометрической или другой биоэлектрической информации в ЭВМ, пригодной в качестве элемента мониторинга биосферы (Туманов, 1998).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Использование в качестве аналитических индикаторов микроорганизмов различных систематических и физиологических групп дает возможность создания методов с различной избирательностью определения.
Из приведенного обзора литературы видно, насколько многообразны ответные реакции микробных культур на воздействие химических элементов и соединений, а также насколько разнообразны способы их трансформации в аналитический сигнал. Выбор наиболее эффективных из них зависит от механизма и глубины воздействия вещества на индикаторный организм, что, в свою очередь, определяет чувствительность и избирательность биометода (Туманов, 1998).
Высокая специфичность методов может быть достигнута применением ауксотрофных штаммов, то есть штаммов, зависимых от наличия в среде тех или иных веществ.
В целях повышения избирательнocти и чувствительности определения биологически активных веществ обоснован новый химико-биологический подход, основанный на предварительном, изменении биологической активнocти определяемого вещества в процессе пробоподготовки. Рассматриваются другие приемы решения поставленных задач путем повышения температуры анализируемого раствора, использования экстракции, биоаккумуляции и нестандартных методик анализа (Постнов, 1999).
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Авакян З.А. Микробиология. Итоги науки и техники / З.А. Авакян - М., 1973.-Т.2. -С. 5-45 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
2. Биоиндикация и биотестирование ксенобиотиков. Комплексное биотестирование нефтезагрязненных почв / Н.А. Киреева, Т.Р. Кабиров, И.Е. Дубовик // Теоретическая и прикладная экология. -2007. - №1
3. Бродский Е.С. Методы исследования состава органических соединений нефти и битумоидов / Е.С. Бродский - М.: Наука, 1985. - С. 57-126 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
4. Бродский Е.С. Экологическая химия / Бродский Е.С., Клюев Н.А. -1994 -Т.3-№1 -С.49-57 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
5. Бродский Е.С. Экологическая химия.// Е.С. Бродский, О.Н. Филина, И.М. Лукашенко и др. -1997 -Т.6 - №1 - С.24-28 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
6. Бродский Е.С. Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды / Е.С. Бродский, С.А. Савчук // Журнал аналитической химии. - 1998 . - Т.53, №12. - С. 1238-1251.
7. Гашинский В.В.Микробиология / В.В. Гашинский -1973.-Т.42.-№4.-С.737-740 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
8. Глухова М.Н. Анализ окружающей природной среды / М.Н. Глухова, А.А. Туманов - Сб. ГГУ. Горький, 1980. -С.14-20(цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
9. Данилов В.С. Антибиотики / В.С. Данилов, Н.С. Егоров -1988. №4. - С. 304 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
10. Дмитриев М.Т. Санитарно-химический анализ загрязняющих веществ в окружающей среде / М.Т. Дмитриев, Н.И. Козина, Н.А. Пинигина - М.: Химия, 1989.- С. 287 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
11. Егоров Н.С. Микробы- антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности / Н.С. Егоров - М.: Высшая школа, 1965. - 211с. (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
12. Зуев Б.К. / Б.К. Зуев, О.К. Тимонина, В.Д. Подругина // Журн. Аналитической химии. - 1995. - Т.50. - №6 - С.663-668(цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
13. Исидоров В.А. Органическая химия атмосферы / В.А. Исидоров -Л.: Химия,1992 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
14. Исмаилов Н.М. Микробиологическая и ферментативная активность нефтезагрязненных почв / Н.М. Исмаилов //Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М., 1988.
15. Крайнюкова А.Н. // Методы биотестирования вод: Сб. Ин-та хим. физ. АН СССР Черноголовка,1988. - С.4-13 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
16. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод //Ю.Ю. Лурье - М., Химия, 1984.-С. 302 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
17.Методы биотестирования вод: Сб. Ин-та хим. физ. АН СССР./ Сост. Н.А. Потапова, Т.В. Королевская - Черниговка, 1988. -С.17-18. (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
18.Месробяну Л. Физиология бактерий / Л. Месробяну, Э. Пэунеску - Меридиане, 1963. - 807 с. (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
19.Немировская И.А., Аникеев В.В., Теобальд Н., Раве А. // Журн. аналит. Химии, 1997. -Т.2 -№4 -С. 392-396 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
20. Нестерова Г.Н. Биология протея / Г.Н. Нестерова - Горький: ГГУ, 1972. - 59 С. (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
21. Основные свойства нормируемых в водах органических соединений // М.,1985. - С. 92 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
22.Павленко В.В. Метод оценки токсичности и мутагенности сточных вод и химических соединений / В.В. Павленко, Л.А. Демидова, Л.Я. Трубачева и др. // Методы биотестирования вод: Сб. Ин-та хим. физ. АН СССР. Черноголовка, 1988. - С. 73-77 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
23. Петрикевич С.Б. Оценка углевородокисляющей активности микроорганизмов / С.Б. Петрикевич, Е.Н. Кобзев, А.Н. Шкидченко // Прикладная биохимия и микробиология. – 2003. – Т.39, №1. – С. 25-30.
24.Положение о Единой государственной системе экологического мониторинга. Утверждено Приказом Минприроды России №49 от 9.02.95 г.
25.Постановление губернатора Иркутской области от 19.12.96 № 442-п «О территориальной системе экологического мониторинга Иркутской области»
26.Постановление Совета Министров Правительства РФ от 24.11.93 г. № 1229 «О создании единой государственной системы экологического мониторинга»
27. Постнов И.Е. Биологический метод анализа: проблемы избирательности и чувствительности определения биологически активных веществ / И.Е. Постнов, А.А. Туманов // Журн. аналит. химии. – 2000. - Т.55, №2. - С. 208-211.
28. Рекламный листок фирмы Hach
29. Рубенчик Л.И. Микроорганизмы- биологические индикаторы / Л.И. Рубенчик. - Киев: Наукова думка, 1972. - 161 с. 77 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
30. Руденко Б.А. Методы определения токсичных загрязняющих веществ в морской воде и донных осадках. // Б.А. Руденко, К.П. Федоров, Б.А. Виноградов и др. М.: Гидрометеоиздат, 1981. - С. 87-92 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
31. Руководство по контролю загрязнения атмосферы. РД 542.04.186-89// М.: Гидрометиздат, 1991, 321 с. (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
32.Руководство по методам химического анализа морских вод / Под ред. Орадовского С.Г.- Л.: Гидрометиздат, 1977. С.118
33.Савчук С.А. / Журнал аналит. химии // С.А. Савчук, Б.А. Руденко, Е.С. Бродский и др. // 1995. - Т.50. - № 11- С.1181-1187(цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
34.Санитарные правила и нормы. № 4630-88(цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
35.СЗ РФ. 1997. №21. Ст. 2483 Рубенчик Л.И. Микроорганизмы- биологические индикаторы / Л.И. Рубенчик. - Киев: Наукова думка, 1972. - 161 с. 77 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
36.Сенцова О.Ю. Успехи микробиологии / О.Ю. Сенцова, В.Н. Максимов. – М: Наука, 1985. – Вып. 20. С. 234-237.
37. Смирнов Б.А. Методы исследования состава органических соединений нефти и битумоидов / Б.А. Смирнов. – М: Наука, 1985.- С. 198-131
38.Сиволодский Е.П. А.с.№1786340. СССР.// Б.и., 1974. №45. С. 69 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
39.Туманов А.А. Физико-химические метода анализа / А.А. Туманов, М.Н. Глухова, Г.М. Субботина - Сб. ГГУ: Горький, 1982.-С. 114-117. (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
40.Туманов А.А. Ответные реакции микроорганизмов на изменение химического состава среды и трансформация их в аналитический сигнал / А.А. Туманов, М.Н. Глухова, Г.М. Субботина // Журнал аналитической химии, 1998.-Т.53.-С. 1252-1260
41.Туманов А.А. Методы биотестирования вод / А.А. Туманов, С.М. Фролова, М.Н. Глухова // Сб. Ин-та хим. физ. АН СССР Черноголовка, 1988. - С. 73-77(цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
42.Хмельницкий Р.А. Масс-спектроскопия загрязнений окружающей среды / Р.А. Хмельницкий, Е.С. Бродский // М.: Химия, 1990. -С. 182(цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
43.Хромченко Я. Л. Химия и технология воды/ Я.Л. Хромченко, Б.А. Руденко //1981. - Т.3. - №1. - С.22-55(цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
44. Шляхов А.Ф. Газовая хроматография в органической геохимии./ А.Ф. Шляхов - М.: Недра, 1984. -221 С (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
45. Экологический мониторинг нефтегазовой отрасли. Физико-химические и биологические методы: учеб. пособие. / Саксонов М. Н., Абалаков А. Д., Данько Л. В. и др.- Иркутск: Иркут. ун-т, 2005. – 114 с.
46. Brown B., Boveri L.// Пат. №2228407 (Франция), РЖХ,1976.Т.6 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
47. Butt J.A., Duckworth D. F., Perry S. G. // Characterisation of Spilled Oil Sampless, Chichester :Wiley.1986 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
48. Gladilovich D., Kindukhov W., Kracheninnikov А., Stгоganov А. // In. congress оп analytical chemistry. Moscow, Russia, June 15-21. 1997. Abstacts. У. 2. N, 21 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
49. Gobet A.B., Wirssen C., Jun Jones G. E.// Gen. Microbiol. 1970. V.62. P/ 159-167 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
50. Kavanagh F. // Analytical microbial. N.Y.: Acad. Press, 1963(цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
51. Kocch O.G., Koch- Dedis J.A.// Handbuch der Spurenanalis. 1964. B.2.№4 P. 1115-1163(цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
52. Lancas F. M. Cfrrilho E., Daen G.H.N., Camilo M.C.F.// J. of high resolution chromatography. 1989. У. 12. Р. 368-371(цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
53.Massoud M.S., Al- Abdali F., Al- Ghadban A. N., Al- Saravi M. // Environmental pollution. 1996. V. 93. № 3. Р.285-302 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
54.Massoud M.S., Al- Abdali F., Al- Ghadban A. N., Al- Saravi M. // Environmental pollution. 1996. V. 93. № 3. Р.271-284 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
55.Mitruka B.M, Alexander M. // Appl. Microbiol. 1975. V. 16. № 4. P. 636-640
56.Monk P.R. Process Biochem/ Monk P.R- 1978, V.13. № 12 P. 4-5 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
57.Мullег D., Wellner В.// Dtsch. gewasserk. Mitt. 1975 B.19 S. 120-123 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
58.Nicolas D.Y.D. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1966. V. 137.№1.P. 217-231(цитировано по Постнов, Туманов, 2000)
59.Oil in the Sea. Inputs, Fate and Effect. Washington D. C., NAS, 1985. P. 600 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
60.Paasivirta J., Herzchuh R., Lahtipera M. et al.// Chemosphere.1981. V. 10. №8. Р. 919-928(цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
61.Ramsdale S.J., Wilkinson A. //J. Inst. Petr, 1968. V. 54. P. 326 (цитировано по Бродский, Савчук, 1998).
62.Rosenberg B., Renshaw E., Wancamp L.// Bacterol. 1967. №33. Р. 716-732 (цитировано по Туманов, Глухова и др., 1998).
63.Биоремедиация загрязнённых нефтью и нефтепродуктам почв без экскавации и перемещении грунта [Электронный ресурс].-1999— . — Режим доступа: file:D:\USER\TK\Internet\нефть-1.НТМ,свободный
64.Университет Гент, Бельгия (LETAE) под руководством проф. G. Persoone [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://www.microbiotests.be/
0 комментариев