Идентификация протеиназ в ПААГ [16]

2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ [16].

Для проявления в гелях полос с протеиназой их выдерживали в денатурированном растворе гемоглобина 2% концентрации в течение 15 – 30 минут при температуре 30^oС. Затем промывали несколько раз дистиллированной водой и переносили в раствор амидочерного. Проводили окрашивание в течение 20 – 30 минут. Краситель отмывали 7% уксусной кислотой. Если в гелях присутствовала протеиназа, то появлялись белые полосы.

Все опыты, описанные в работе, проводили 3 –4 раза, аналитические определения для каждой пробы проводили в двух – трёх повторностях. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из двух или трех определений. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕИНАЗЫ

 PENICILLIUM WORTMANNII 2091 И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

Известно, что микроорганизмы синтезируют богатые набором ферментов комплексы. Поэтому важным этапом в получении препаратов направленного действия является изучение условий их выделения, очистки от сопутствующих биологически активных и баластных веществ. В связи с малой изученностью представителей грибов Penicillium этот этап представляет особую важность.

3.1 Разработка условий выделения препарата

Penicillium wortmannii BKMF 2091.

Для выделения ферментов из различных сред в лабораторных условиях и в промышленности чаще всего применяют органические растворители и нейтральные соли.

Эффект осаждения белков органическими растворителями, как известно [7], основан на явлении уменьшения сольватации полярных групп фермента. Молекулы воды, расположенные на гидрофобных участках поверхности белка, могут быть замещены на молекулы органического растворителя. При этом растворимость белков падает, происходит агрегирование и осаждение белковых молекул.

В качестве осадителей использовали 96,5% этанол, 98,0% изопропанол, химически чистый ацетон и сульфат аммония. Органические растворители и сульфат аммония добавляли к охлажденной до 0 – 4^oС культуральной жидкости Pen. Wortmannii 2091 при различных значениях рН и постоянном перемешивании. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, растворяли в небольшом объёме дистиллированной воды и определяли протеолитическую активность.

Результаты исследования влияния рН на полноту осаждения протеолитического комплекса при концентрации растворителей 60% представлены на рис. 1, из которого видно, что оптимальным является значение рН 7,5 при использовании всех видов органических растворителей. Вероятно, изоэлектрическая точка для данного фермента лежит в этой области рН.

В дальнейшем нами проводились исследования по влиянию концентрации органических растворителей на выход фермента при оптимальном значении рН. Наблюдалось монотонное осаждение фермента при последовательном увеличении концентраций осадителей, выход фермента возрастал до определённого предела (табл. 1).

Как видно из табл. 1, концентрация органических растворителей значительно влияет как на выход протеолитического комплекса, так и на степень его очистки. При использовании этанола наиболее эффективной для выхода ПА была концентрация 72,0%. Степень очистки 1,27. Максимальный выход 98,5% по активности.

Оптимальная концентрация ацетона 66,6% (в объёмных соотношениях 1: 2). Степень очистки была более высокой, чем для этанола (1,5 раза) – однако выход по активности всего 62%. Лучшим органическим осадителем для протеиназы Pen. Wortmannii 2091 явился изопропанол. При концентрации его в смеси 50% выход протеиназы составил 90, 5%, степень очистки 2,78 и удельная активность 3,06.

Таким образом, изопропанол избирательно осаждает протеолитические ферменты, что повышает степень их очистки и снижает содержание баластных примесей. Однако на практике вполне можно использовать и этанол.

В дальнейшем проведены исследования по осаждению протеиназы сульфатом аммония. Было установлено, что при оптимальных условиях (степень насыщения 0,8 рН 7,5) выход фермента составил всего 23%. Низкий вы-

		Рис. 1. Влияние величины рН на осаждение протеолитического комплекса различными растворителями: ось абсцисс – величина рН; ось ординат – выход по активности в %; 1 – этанол; 2 – изопропанол; 3 – ацетон.

Получение препарата протеиназы из культуральной жидкости Penicillium wortmannii 2091

осаждением органическими растворителями.

ход фермента не позволил в дальнейшем использовать эту соль для получения препарата Pen. Wortmannii BKMF 2091.

Из анализа вышеприведённых данных можно сделать вывод, что для осаждения препарата протеиназы целесообразно применение этанола и изопропанола. В зависимости от назначения препарата возможно применение этого или иного растворителя с практически одинаковым эффектом.