Молекулярно-генетические методы

2.2.2. Молекулярно-генетические методы

В ходе выполнения работы было исследовано 6 полиморфных вариантов генов цитохромов Р450 (CYP2C19, CYP2E1) и глутатионовых S-трансфераз (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) (табл. 4).

Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК из банка НИИ медицинской генетики (семейная выборка больных БА и контрольная выборка) и ДНК, выделенную из цельной венозной крови (семейная выборка больных ТБ) по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис и др., 1984; Lahiri et al., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20°С до проведения эксперимента.

Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл. 5). Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10´ буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е.а. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», «Медиген», Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа «Эппендорф», наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах «MJ Rеsearch» (США) и «ЦиклоТемп 105» (Россия-Австрия).

Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94°С в течение 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60°С (1мин.), элонгации цепи при 72°С (40 сек.) и денатурации при 94°С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 3 минут. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл.4) при оптимальной для фермента температуре на протяжении 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10´ буфера для рестрикции, поставляемого фирмой – производителем («Сибэнзим», Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Продукты рестрикции фракционировали 20-30 минут в 3% агарозном геле при напряжении 120 В. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолетовом свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе «UV-VIS Imager-II» (США).

Характеристики исследованных полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков

2.2.3. Статистические методы анализа

Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью точного теста Фишера [Вейр, 1995].

Ожидаемую гетерозиготность полиморфизма генов цитохромов Р450 (CYP2C19 и CYP2E1) и глутатионовых S-трансфераз (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) рассчитывали по опубликованным методикам [Животовский, 1984]. Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле:

D=(h_obs–h_exp)/h_exp,

где h_obs и h_exp – ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно.

Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с туберкулезом и бронхиальной астмой, а также с качественными патогенетически важными признаками заболеваний, сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий χ² с поправкой Йетса на непрерывность, а также с применением двустороннего точного критерия Фишера.

Об ассоциации разных генотипов (или их комбинаций) с заболеваниями судили по величине отношения шансов (odds ratio (OR)) [Pearce, 1993], величины, показывающей, во сколько раз выше вероятность заболеть для индивида с определенным генотипом (или комбинацией генотипов):

OR= (A/B)/(C/D), где

А – число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе больных;

С - число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе здоровых;

В – число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе больных;

D - число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе здоровых.

Значения OR>1 указывают на возможную положительную ассоциацию с заболеванием. Обсуждение величин OR проводили при уровне значимости не более 5%.

При анализе семейного материала для поиска ассоциаций с генетическими маркерами был использован тест на неравновесие по сцеплению – Transmission/Disequilibrium Test (TDT):

TDT= (b-c)²/(b+c)²,

где b и c – число наследуемых аллелей от гетерозиготных родителей [Spielman, 1993]. TDT рассматривает вероятности передачи маркерного аллеля от гетерозиготного родителя больному потомку и отклонение этой вероятности от 0,5 может появиться только тогда, когда есть сцепление между маркерным локусом и локусом, контролирующим болезнь [Аксенович, 2001]. Этот тест имеет ряд существенных преимуществ: помимо того, что обладает высокой статистической мощью, к тому же устойчив к эффектам популяционной структуры (подразделенность, гетерогенность, примесь и т.д.), практически безотносителен к типу наследования.

При статистически значимых отклонениях распределения количественных признаков от нормального (по данным теста Шапиро-Уилки), сравнение проводили с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса.

Для сравнения средних значений признаков до и после лечения применяли тест Уилкоксона [Гланц, 1998].

Для оценки параметров распределения, включая средние значения, стандартные отклонения использовали стандартный набор статистических процедур [Лакин, 1990]. Усреднение статистически значимых коэффициентов корреляции проводили с помощью z-преобразования Р. Фишера, после проверки на значимость различий полученных коэффициентов корреляции [Лильин и др., 1984].

Все расчеты проводили с использованием пакета прикладных программ “STATISTIСA for Widows 6.0” и в программе “Microsoft Excel 97”.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ